高效液相色谱法

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1、高效液相色谱法1 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱 柱，对供试品进行分离侧定的色谱方法。注人的供试品，由流动相带入柱内，各 组分在柱内被分离，并依次进人检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色 谱信号。1.1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和 色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局 “液相色谱仪检定规程 ” 定期检定并符合有关规定。色谱柱内径一般为3.94.6口m,填充剂粒径为3 10m。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2 口 m）填充剂的耐超高压、小进样 量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。

2、1.1.1 色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的 载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等；常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅 胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱：用硅胶填充剂,或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常 见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合 硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱 柱和阴离子交换色谱柱。手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度,填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键 合基团的表面覆盖度、载体表面基团残

3、留量,填充的致密与均匀程度等均影响色 谱柱的性能,应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果,品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温,应注意室温变 化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60C。最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂， 以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅 胶（如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等 ）也有使用。正相色谱系统使用极性填充 剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂 ;分子排阻 色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性 填充剂

4、。填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖 度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分 离效果。孔径在15nm（lnm=10A）以下的填料适于分析分子量小于2000。的化合 物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在310pm之间。粒径更小（约 2pm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必 须与之匹配;如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议 时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。以硅

5、胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40C，为改善分离效果 可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60C。流动相的pH值应控制在2-8之间.当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解； 当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用 pH 值大于 8 的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有 高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或 非硅胶填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具 有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅 烷键合硅胶填充剂，或有机一无机杂化填充剂等。1.1.

6、2 检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测 器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电 化学检测器和质谱检测器等。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响 应值不仅与待测溶液的量有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示 差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应，结构相似的物质在蒸 发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学和示差折光检测器的响应值与 待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与待测 溶液的浓度通常呈指数关系，故进行

7、计算时，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外-可见分光检测器，所用 流动相应符合紫外一可见分光光度法（中国药典2015 年版四部通则 0401）项 下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波 长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含 不挥发性盐组分的流动相。1.1.3 流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇一水系统和乙腈 -水系统，用紫 外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需 用时应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中 有机溶剂一般不低于 5%，否则易导

8、致柱效下降、色谱系统不稳定。正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己各品种项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外， 其余如色谱柱内径、长度、填充剂粒径、流动相流速、混合流动相各组分的比例、 柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适 用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时， 当小比例组分的百分比例 X 小于等于33%时，允许改变范围为0.7X1.3X；当乂大于33%时，允许改变范围 为 X-10%X+10%。若需要用小粒径（约2 口 m）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体 积和系统的死体积等必须与之匹配；如有

9、必要，色谱条件也应作适当的调整。当 对其结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种正文 项下注明。1.2 系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、重复性和拖尾 因子等五个参数。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系 统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当 调整，应符合要求。2.1.1 色谱柱的理论板数 (n) 用于评价色谱柱的效能。由于不同物质在同一色 谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物 质，一

10、般为待测组分或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR和峰宽(W)或半高 峰宽(Wh/2)，按n=16(tR/W)2或n=5.54 (tR/ Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。tR、W、 Wh/2可用时间或长度计(下同)，但应取相同单位。2.1.2分离度(R)用于评价待侧组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程 度，是衡量色谱系统效能的关键指标.可以通过测定待测物质与已知杂质的分离 度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物质或其他难分离 物质)的分离度，或将供试品或对照品用适当

11、的方法降解，通过测定待测组分与 某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与调整。无论是定性鉴别还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或 特定的杂质对照色谱峰及其他色谱峰与相邻色谱峰之间有较好的分离度。除另有 规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为R=2(tR2 tRi)/(Wi+W2)或 R=2(tR2 一 tR1)/1-70(Wi.h/2+W2.h/2)式中，tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tRl为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2及W1h/2、W2.h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数(n)和分

12、离度(R)均以峰宽(W)的 计算结果为准。2.1.3 重复性 用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法 时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积 测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时，通常配制相当于 80%.100%和 120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成 3 种不同浓度的溶液， 分别至少进样2 次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于 2.0%。2.1.4拖尾因子(T)用于评价色谱峰的对称性。拖尾因子计算公式为：T=W0.05h/2d1式中，可0側为5%峰高处的峰宽；d1为峰顶在5%峰高处横坐标平行线的投 影点至峰

13、前沿与此平行线交点的距离。以峰高作定量参数时，除另有规定外，峰高法定量时T应在0. 951.05之 间。以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重 拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在各品种正 文项下对拖尾因子作出规定。2.1.5灵敏度 用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比(S/N)来 表示。通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-028咼效液相色谱法第5页共10页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草郭欣时，信噪比应不小于10；定性测定时，信噪比应不小于3。系统适用性试

14、验中可以设置灵敏度实验溶液来评价色谱系统的检测能力。1.3 测定法1.3.1 内标法按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液， 精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色 谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子校正因子(D=(As/cs)/(Ar/cr)式中AS为内标物质的峰面积或峰高；Ar为对照品的峰面积或峰高；Cs为内sRs标物质的浓度;CR为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供 试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量含量(cx)=f.Ax/(As/c9式中，

15、Ax为供试品峰面积或峰高；ex为供试品的浓度；As为内标物质的 峰面积或峰高；c为内标物质的浓度；f为内标法校正因子。采用内标法，可避免因样品前处理或进样体积误差对测定结果的影响。1.3.2 外标法 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，进样，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰 面积或峰高），按下式计算含量含量（Cx）=CR（Ax/Ar） 式中各符号意义同上。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂 质含量时，以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜。1.3.3 加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取待测物对照品和参比物质对照品各适量，配作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-028咼效液相色谱法第6页共10页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草郭欣制待测物校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按下式计算待测物的校正因子。校正因子=（cA/AA）/（cb/AB）式中cA为待测物的浓度；AA为待测物的峰面积或峰高;；cB为参比物质的 浓度;；AB为参比物质的峰面积或峰高。也可精密称（量）取主成分对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓 度的溶液，进样，记录色谱图，绘制主成分浓度和杂质浓度对其峰面积的回归