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1、word石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生某某学号专业年级、班级指 导 教 师所在学院中国某某石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白GFP在大肠杆菌中的表达的情况以与鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进展培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性与其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1 实验目的掌握聚合酶链式反响(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；
2、锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。1.2 实验背景 绿色荧光蛋白green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进展细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反响底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对
3、受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以与相互作用、信号传递、转染与转化，以与细胞的别离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢与追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反响不是酶反响，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝
4、光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进展定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进展检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。原核表达是将克隆基因插入适宜载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不与哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株与与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的
5、蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性与构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。1.3 流程图：2材料与方法 质粒DNA;PCR产物、酶切质粒、DNA Marker;外源DNA片段：PCR扩增回收目的片段A和PGM-Tvector(Amp,lacZ),带限制性内切酶末端的DNA溶液目的片段A和载体片段pBL; DH-5受体菌R-M-，自提的质粒或重组子;重组质粒DNA的菌落、BL21;重组GFP质
6、粒、标准蛋白。 PCR仪、PCR管、移液枪、离心机、电泳仪、涡旋振荡器、冰箱、透射仪、紫外透射仪、刀片、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、Eppendorf管、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、振荡培养箱、移液器、摇床、酒精灯、培养皿、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、分光光度计。模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buffer(内含Mg2+)、ddH2O、pGM-T载体、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒，其它生化试剂皆为国产分析纯。2.2.1 PCR扩增目的基因片段(1) 依次混匀如下试剂，反响体系如下：PCR反响体系各成分的量ddH2O 9.5 m
7、l上游引物 1.0 ml下游引物 1.0 ml模板DNA 1.0 mlTaqDNA聚合酶12.5 mlTotal 25 ml 混匀后瞬时离心(2)将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性94 3 min，变性94 30s，退火52 30s，延伸72 40s 30个循环。总延伸72 4 min； 温度 时间预变性943min变性9430S退火5230S延伸7240S总延伸72240S(3)PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上；(4)取5ml扩增后产物，进展琼脂糖电泳检测。1加20ml 1TAE缓冲液于三角瓶中；2准确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化；3
8、冷却至60左右，加1l的Goldview溶液，摇匀；4轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上；5轻轻拔除梳子，将胶放入电泳槽中，参加电泳缓冲液TAE，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm；6取5l质粒DNA与2l加样缓冲液混匀上样；7110v约电泳0.51小时；8紫外透射仪观察结果。2.2.3 DNA的回收和纯化回收PCR产物采用天根时代DNA回收试剂盒:1用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，分别放入1.5ml离心管中；l的体积参加PN;350水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解；4将上述的得到的溶液参加到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12
9、000rpm离心60s，弃掉废液；5参加700l漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；6参加500l漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；7将离心吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min；8取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置参加适当的洗脱缓冲液EB 30l，洗脱缓冲液先在65水浴预热，冷却至室温，12000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，12000rpm离心1min；9电泳检测回收产物，余置于-20下保存。透射仪观察结果，并拍照。 把PCR扩增的目的基因片段产物与pGM-T载体连接，反响体系如下：体系成分体积(L)dd
10、H2O10T4 DNA目的片段回收pGM-T载体T4 DNA ligaseTotal大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备采用CaCl2法。1将实验室保存的 DH-5菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37、200rpm震荡培养过夜，活化 DH-5菌株；2按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转瓶接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37,200rpm震荡培养至OD600值为0.5左右；3在已灭菌的10ml离心管
11、中吸取上述培养液10ml，冰水浴10min后，4、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；2溶液，重悬菌体，冰浴10min，4、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；2的溶液中，轻轻重悬菌体沉淀，冰上放置10分钟；6分装100L/管冰浴分装，置于-70冰箱中保存。(1)转化用固体LB培养基平板制备：向含100g/ml氨苄青霉素AMP的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG16l和20mg/ml的X-gal 40L，用灭菌弯头玻璃棒涂布均匀，37避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。参加ITPG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。2连接
12、产物转化 DH-5感受态细胞：取5l连接产物加到100l DH-5感受态细胞中。轻弹混匀，水浴20min。取出离心管，42 水浴中热激90 后，立即置冰浴中冷却5min。向离心管中参加800L 37预热的无抗生素的LB液体培养基。取出离心管，12000rpm离心2min，弃上清800L，用剩余的约100L上清将沉淀菌体吸打混匀后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。将平板倒置在37恒温箱中培养14h18h，直至长出菌落，观察结果。重组质粒的菌落鉴定本次实验所用的pGM-T vector 含Ampr、lacZ基因，所以有重组质粒的菌落为白色，没有重组质粒的菌落为蓝色。具体操作如下：挑取菌落：使
13、用无菌枪头随即挑取5个白色菌落，放入含氨苄青霉素的LB液体培养基的1.5ml EP管，振荡培养4h以上，吸取0.5ul菌液作为PCR反响模板，其余继续培养。PCR反响体系与反响程序均与目的基因扩增条件一致。扩增产物取5ul用1%琼脂糖凝胶进展检测。 将鉴定为阳性重组子的质粒EP管挑取出来，按照实验室提取质粒的试剂盒说明书操作。提取后，取5ul用1%琼脂糖凝胶进展检测。用限制性内切核酸酶BamH和Sal对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。酶切反响体系如下表。体系成分体积质粒去离子水11ul10Buffer TBamH120U/ulSal(100U/ul)总体积20ul37酶切过夜，70灭活酶
14、活性。1%琼脂糖凝胶进展检测。2.2.10 GFP基因重组表达质粒与诱导表达1将上步经酶切鉴定得到的GFP目的片段与表达质粒连接，并转化至大肠杆菌BL21菌株。转化菌涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37过夜培养；2观察菌落生长情况，进展菌落PCR鉴定；3将鉴定为阳性的菌落接种于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37摇菌培养过夜。4按1:100稀释过夜菌，接种于100ml含有卡那霉素的LB培养基中，37摇菌继续培养至A600约为0.4-0.8。5取局部液体作为未诱导的对照组，余下的参加IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，于37诱导表达。每隔1h分别取菌体1ml，离心12000g，30s得到沉淀，观察蛋白表达情况。2.2.11 SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白1取未诱导、诱导不同时间的培养物500ul于微量离心管中，室温高速离心1min。沉淀悬浮于100ul 1SDS凝胶加样缓冲液中，100加热3min，室温高速离心1min后，冰上放置。2安装电泳装置，配制12%别离胶倒入凝胶槽，加蒸馏水密封。待凝固后再倒入5%浓缩胶，插上梳子。待凝固后，拔出梳子，放入
