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1、项目名称： 癌细胞微环境中蛋白质因子的功能与调首席科学家起止年限依托部门李鲁远 南开大学2009.1 至 2013.8天津市科委 教育部一、研究内容总体设想我们将着重于对乳腺癌的研究，应用不同的细胞和动物模型以及人类患者的组织病理标本 进行研究，阐明癌细胞微环境中的上述蛋白因子在肿瘤生长和转移的作用机理，并紧密结 合临床医学，探寻肿瘤预防和治疗的有效途径和新的药物靶点。拟解决的关键科学问题以多种细胞和动物模型及人类患者的组织标本为研究对象，揭示肿瘤微环境中重要的蛋 白因子在肿瘤的发生、发展和转移等过程中的重要的病理改变的分子基础、蛋白分子网络 及其信号传导途径，在分子水平阐述肿瘤发生和转移的机
2、制，探寻肿瘤防治的有效途径和 新的药物靶点。为此，我们提出以下四个研究课题：一、VEGI激活免疫系统并抑制由骨髓 来源的内皮前体细胞支持的肿瘤血管生长的机理；二、PINCH-ILK复合体及转录因子ATF4 在细胞粘附与癌细胞骨转移、生长及骨破坏的作用机理；三、趋化因子MCP-1及其受体信 号传导途径为靶向的乳腺癌骨转移的研究；四、Omega-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)合成 酶FAT-1抑制肿瘤的作用机理。癌细胞微环境里的这些蛋白因子都在一定程度上参与血管 生成，细胞黏附和移动，癌细胞骨转移，和膜蛋白受体信号传递。同时，这些蛋白因子在 细胞内的作用都在一定形式上经过核因子NFkB的中介
3、。因此，这四个课题密切相关、相辅 相成。研究内容一、抑制由炎症促进和由骨髓干细胞来源的内皮前体细胞支持的肿瘤血管生长我们的研究表明，VEGI有抑制肿瘤新生血管生长和激活免疫细胞的作用，这种作用使 VEGI可能成为抗肿瘤的药物制剂。我们为进一步的研究提出以下两个假说：1)VEGI通过 树突状细胞(DC)发挥部分抗肿瘤的作用；2)VEGI可以抑制内皮前体细胞(EPC)支持的肿 瘤血管新生。为了对上述假说进行验证，我们提出了两个明确的研究方向：1、研究VEGI是否通过激活DC导致肿瘤生长抑制。我们将探讨以下三个问题：1) VEGI是否能够激活宿主体内DC抗肿瘤细胞毒性以及能否诱导DC分泌Th 1型细
4、胞因子。2) VEGI是否能够诱导DC细胞对肿瘤的浸润，并刺激DC的成熟以提高它们杀伤肿瘤细胞的活 性。3) 用DC缺失型的免疫无能裸鼠来研究VEGI抗肿瘤的作用在何种程度上依赖于DC激活的宿主 免疫系统。2、研究VEGI对EPC导致的肿瘤血管发育产生何种影响：1) VEGI是否对骨髓造血干细胞(HSC)和内皮前体细胞(EPC)的形成有直接的抑制作用。2) VEGI是否能够抑制EPC支持的肿瘤血管发育和生长。3)在已被VEGI消除了血管内皮细胞的肿瘤里，EPC能否修复内皮细胞缺损的血管。二、细胞粘附、迁移和凋亡在乳腺癌发生及发展过程中的作用1. 阐明细胞粘附和迁移的分子机理。近年来发现的PIN
5、CH-ILK-Parvin复合物在调节细胞 粘附和迁移上起关键作用。然而，在分子水平上这个复合物是怎样调节细胞粘附和迁移仍 然不清楚。我们最近发现这个复合物对特异性粘附以及细胞骨架蛋白有作用。本课题研究 的一个重点内容是证明这些相互作用，研究他们是怎样调节细胞粘附和迁移以及信号传导 途径。2. 证明ILK和相关蛋白在血管形成、肿瘤转移中的功能。ILK及相关蛋白是细胞粘附和迁 移所必需的成分，因此，通过抑制ILK复合物有可能达到抑制血管形成和肿瘤转移的目的。3. 乳腺癌细胞中转录因子ATF4在癌细胞增殖过程中的作用。ATF4在细胞增殖中起着非常 重要的作用，ATF4基因敲除小鼠的细胞增殖能力显著
6、下降。调节细胞周期的关键因子 cyclinAl和D1蛋白表达水平也显著下调。我们将研究ATF4在乳腺癌细胞增殖中的作用。4. 乳腺癌细胞中ATF4在癌细胞凋亡中的作用。ATF4已被报导抑制细胞凋亡。我们最近 的预试验结果发现ATF4基因敲除小鼠中成骨细胞前凋亡显著增加。我们将研究ATF4在乳 腺癌细胞在骨组织生存和增殖中的作用。5. 成骨细胞中ATF4在乳腺癌诱导血管形成中的作用。骨骼是具有一种相对缺氧的微环境 的组织，而乳腺癌细胞在骨骼组织中生长和增殖将进一步加重缺氧(hypoxia)。成骨细胞 中高量表达ATF4,缺氧环境刺激成骨细胞表达大量ATF4蛋白质。而后者是血管形成因子 VEGF表
7、达的主要蛋白调节因子。因此ATF4可能是介导乳腺癌诱导血管形成的关键因子。 为此，我们将应用已经建立的体内体外模型研究ATF4在乳腺癌诱导血管形成中的作用。6. 破骨细胞中ATF4在乳腺癌骨破坏中的作用。我们最近的预试验结果发现ATF4基因敲 除小鼠中破骨细胞前体增殖能力显著下降，而且破骨细胞前体不能分化形成具有骨吸收能 力的多核破骨细胞。这些发现表明ATF4调节破骨细胞的增殖和分化。我们将研究ATF4在 乳腺癌骨破坏中的作用。三、趋化因子及其受体信号传导途径为靶向的乳腺癌骨转移的研究我们的假说是，趋化因子和趋化因子受体由肿瘤细胞及骨微环境中的细胞表达和产生, 它刺激乳腺癌细胞的增殖和迁移，同
8、时诱导破骨细胞的形成。这些作用导致乳腺癌引起的 骨质破坏，增强肿瘤细胞在骨微环境中的生长和增殖。因此，趋化因子和趋化因子受体信 号传导途径可能在乳腺癌骨转移中发挥非常重要的作用。1. 首先通过MCP-1 knockout鼠与SCID小鼠杂交，产生MCP-1-/-SCID鼠，这种小鼠的骨 微环境中MCP-1的产生将缺失。2. 我们将观察骨微环境中MCP-1的丢失是否减少肿瘤细胞在骨骼中的生长及骨质破坏的形 成。我们将肿瘤细胞(MDA-231 or MCF-7)直接注射到基因knockout鼠及正常对照鼠的 骨髓腔中(tibial-injection)，然后通过骨计量学、microCT等技术检测肿
9、瘤的生长及 骨质的损伤；3. 观察骨微环境中MCP-1的丧失是否减少肿瘤骨转移的发生。我们将肿瘤细胞用荧光素酶 或绿色荧光蛋白进行标记、扩增，注射到小鼠体内(心脏注射及皮下注射)，应用实时 成像技术，活体观察肿瘤细胞在MCP-1/SCID小鼠体内的转移及造成骨质损伤的过程。四、Omega-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)对肿瘤的抑制作用1. n-3 PUFA抑制人类乳腺癌细胞的体外研究。同时研究其可能机制，包括对脂筏中的蛋白 信号传导的影响，对前列腺素E2的抑制。2. 建立FAT-1/SCID转基因鼠模型并进行相关研究。在利用FAT-1转基因小鼠的实验当中， 戴一凡实验室及合作者发现FAT
10、-1小鼠对接种的同系小鼠肝癌细胞或大肠癌细胞有显著 的抑制作用。我们计划将FAT-1基因引进到严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。利用FAT-1 转基因SCID小鼠作为动物模型来研究n-3PUFA对人类乳腺癌生长和转移的抑制作用以 及探索其机制。构建携带FAT-1基因的双链腺相关病毒载体，研究其在乳腺癌基因治疗 中的作用。二、预期目标总体目标：本研究项目着重于医学、生物学基础理论研究，主要针对癌细胞微环境中细胞因子、 生长因子及其信号传递系统的蛋白质因子动态相互作用对人类重大疾病的影响展开深入研 究，以期揭示肿瘤的发病机理，提出诊断或治疗的新策略、新靶点和新药。我们将着重于 这些蛋白因子的分子网
11、络及其信号传导途径。本项目期望在有关微环境对癌细胞生长和转 移等关键科学问题上取得重大突破性成果，为创建具有国际一流水平的生物医药创新和产 业化基地奠定基础和理论依据。并在完成本项目的过程中，培养一批具有国际影响力的高 水平和创新能力的人才，形成人类重大疾病研究方面的学术梯队，为建设我国肿瘤防治研 究和高水平人才培养的重要基地做出贡献。五年预期目标：1. 阐明VEGI对骨髓造血干细胞来源的血管内皮前体细胞支持的肿瘤血管生长抑制的作用 机理。2. 阐明VEGI在促进树突状细胞（DC）成熟和激活免疫系统抗癌功能方面的作用机理。3. 阐明细胞粘附和迁移的分子机理。在分子水平上揭示PINCH-ILK-
12、Parvin复合物在细胞 粘附和迁移上的关键调节作用。4. 证明ILK和相关蛋白在血管形成中的功能o ILK及相关蛋白是细胞粘附和迁移所必需的 成分，因此，通过抑制ILK复合物就可达到抑制血管形成的目的。5. 阐明转录调节因子ATF4调控乳腺癌细胞生长和凋亡的机理。6. 阐明ATF4在乳腺癌骨转移造成的骨骼破坏中的作用。7. 阐明下调趋化因子和趋化因子受体信号传导途径在控制肿瘤骨转移中的作用机理。8. 阐明n-3 PUFA抑制肿瘤细胞生长和转移的作用机制。9. 培养一批在肿瘤防治等领域具有国际竞争力的优秀中青年科技骨干和后备力量，造就 一支具有攻坚能力、结构合理、创新能力强的科研队伍。五年计划
13、培养博士、博士后 30-40名，力争成为我国肿瘤防治研究和高水平人才培养的重要基地。10. 研究成果主要以研究论文和独立开发的技术成果（专利）形式发表，五年内争取在国 际专业学术期刊上发表高水平研究论文40篇，包括在高影响因子的刊物上。11. 主办1次肿瘤防治方面的国际性学术研讨会。12获得国家、省部级科技奖励多项。三、研究方案总体思路肿瘤是严重危害人民健康的重大疾病。肿瘤的发育、生长和转移是一个极为复杂的生 物学现象，涉及到许多蛋白质翻译后修饰和动态相互作用，细胞内、细胞间信号传递，以 及在分子水平、细胞水平的肿瘤组织微环境、血液和淋巴循环系统、免疫系统整体的调节 和控制机理。涉及到的蛋白质
14、包括作为细胞间调控信号的游离的或细胞膜表面的生长因子、 细胞因子，细胞表面膜蛋白受体、细胞基质糖蛋白、脂蛋白，以及构成细胞内控制生长、 死亡、迁移的信号传递途径。揭示并阐明这些蛋白质的生物学功能，将有助于开发肿瘤预 防和治疗的新策略、新方法、新技术和新药品。我们将集中一个团队的力量，从四个关键方向来揭示和阐明肿瘤生长和转移的蛋白质 修饰和动态相互作用。第一，细胞生长抑制因子VEGI及其受体信号系统在肿瘤血管发育和 肿瘤生长中的作用机理。第二，细胞粘附因子及其受体信号系统在肿瘤细胞生长和迁移过 程中的作用及机理。第三，趋化因子及其受体在癌细胞骨转移过程中的作用及机理。第四， 肿瘤组织中食物来源的
15、不饱和脂肪酸对肿瘤生长的控制作用及机理。这四个互相关联的研 究重点不仅仅表现在共同的目标一肿瘤的防治上，也表现在他们涉及的信号系统的重叠与 相互作用，以及研究中使用的细胞学、动物学模型的共性和互补性。技术途径1）本项目将采取多学科包括生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学及蛋 白质化学等学科，相互交叉、渗透和有机结合的途径，重点围绕蛋白质动态相互作用和信 号传递途径在肿瘤生长和转移中作用机制开展研究。2）使用细胞、组织动物整体及临床标本，使用纯化的重组蛋白因子研究其信号系统。在 细胞和动物模型中使用siRNA和纳米技术，或基因敲除技术造成信号传递的阻断，并研究 其后果。3）建立有关动
16、物模型包括SCID鼠乳腺癌骨转移模型和Q-3不饱和脂肪酸转基因鼠。这些 模型一方面是本项目的研究对策，另一方面可以为下一阶段确立靶体后的新药开发研究提 供临床前实验模型。可行性分析本项目的总体方案是切实可行的。首先，本项目提出的主要科学问题和研究目标不仅 具有理论和实际依据，而且都是该领域前沿性和关键性的问题。我们在肿瘤的血管形成、 肿瘤的粘附、迁移和转移等领域进行了多年的研究，取得了一些重要的成果，具备完成本 项目的坚实基础。研究方案建立在申请者以及项目组成员大量的相关研究工作的基础上， 实验设计合理周密。研究课题所用的方法和材料都是本项目组成员多年应用、被证明是行 之有效的方法；而且，我们的课题组成员积累了大量的关键性研究材料，如各种肿瘤细胞 系，转基因鼠，RN
