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1、雌激素诱导miRNA-29表达在CC14诱导大鼠肝损害中的保护作用背景：雌激素（estradiol, E2）缓解CC14诱导肝纤维化的潜在机制仍不清楚。结果：miRNA-29在CC14处理的雌雄大鼠中的表达存在差异。E2和表达miRNA-29a/b的 腺病毒可以增加肝内miRNA-29a/b水平且缓解CCl4诱导肝纤维化。结论：E2通过诱导miRNA-29a/b抑制CCl4诱导肝损害。意义：了解miRNA-29对肝纤维化的作用/调控并提供新的治疗靶点。摘要：以前研究表明雌性动物比雄性动物更容易耐受CCl4诱导肝纤维化，E2可以抑制 CCl4诱导的肝纤维化。然而，这种现象的潜在机制仍没有完全阐明
2、。本研究报道E2诱导 miRNA-29表达对CCl4诱导肝损害的作用。在用CCl4处理的雌雄大鼠中，肝内miRNA-29表 达存在差异。尤其在CCl4处理4周后的雄性而非雌性大鼠肝内miRNA-29a和miRNA-29b表 达明显下降。在雄性大鼠肝内miRNA-29a和miRNA-29b表达下调与肝纤维化进展早期相关， 结果显示相对于雌性大鼠，雄性大鼠的纤维化标志物表达增加。此外，在雌性大鼠E2比雄 性大鼠一直保持更高水平oTGF-P 1在大鼠肝癌细胞IAR20和正常肝细胞中减少miRNA-29a/b 表达。相反，E2通过抑制NF-K B信号通路提高miRNA-29a/b表达，NF-K B信号
3、通路负性调 控miRNA-29表达。进一步研究发现E2和静注表达miRNA-29的腺病毒可以显著增加 miRNA-29a/b水平和缓解CCl4诱导肝损害大鼠的肝脏纤维化标志物表达。总之，E2通过诱 导肝内miRNA-29抑制CCl4诱导肝损害。纤维化以过量沉积细胞外基质（ECM）为特征，尤其是胶原。肝纤维化是慢性肝病的一 种常见结局，最终可能进展为肝硬化和肝衰竭。CCl4诱导肝纤维化与不同病因引起的人肝 纤维化有一些共同特征；相应地，CCl4诱导肝纤维化已作为纤维化模型1-3o本课题目的 是研究雌雄大鼠对CCl4的不同纤维化反映及E2抑制肝纤维化的潜在机制。以前研究已在动物中观察到对非酒精性纤
4、维化诱导因素（如CCl4）表现出性别差异4， 雌性动物相对于雄性大鼠更耐受CCl4诱导肝纤维化。通过研究这些差异，数个研究已证实 E2抑制CCl4诱导肝纤维化动物模型具有保护作用5-7o Yasuda等6报道E2降低I型和II 型前胶原以及金属蛋白酶抑制剂-1 （TIMP-1） mRNA水平。也有研究发现在卵巢切除后的雌 性大鼠，用E2替代治疗抑制纤维化，而用E2特异性抗体或卵巢切除雌性大鼠中E2的保护 作用消失，E2水平也明显下降。Liu等5报道178 -E2缓解肝纤维化、改善肝功能（指标为 ALT和AST）o Shimizu等8在大鼠肝星状细胞（HSC）中观察到E2抑制肝纤维化的保护作用
5、可能与抑制HSC激活有关。虽然已知E2作为强大的内源性抗氧化剂，通过抑制活性氧化剂 或间接调控细胞因子和其他生长因子的合成和释放，达到抑制肝纤维化作用，但E2抑制肝 纤维化的潜在机制仍没有完全阐明。微小RNA （miRNA）是长约22nt的非编码RNA，与细胞靶基因mRNA的3非编码区序 列不完全互补配对调控转录后基因表达9-11o以前研究已表明miRNA在细胞各个过程中起 作用，包括细胞增殖、分化和凋亡。大量研究报道miRNA异常表达会导致多种疾病的发生 发展。许多报道表明miRNA在HSC激活过程中起着重要的作用。对激活型大鼠HSC中miRNA 表达分析证实了 miRNA表达上调或下调12
6、o也有研究证实过表达的miR-16和miR-15通过 下调线粒体相关抗凋亡蛋白Bcl-2，导致caspases3、8、9激活，从而抑制HSC增殖和诱导凋 亡13o这些发现表明miRNA通过激活HSC在肝纤维化进展中起着重要的作用。miR-29家 族（包括关键胶原调节分子miR-29a和miR-29b）也参与了组织纤维化14-16在心肌梗死 过程中，人和鼠的心脏边界miR-29a和miR-29b表达下调17o此外，miR-29作为一个主要 调节分子参与了肺纤维化15o最近，Roderburg等16在分析了 CCl4诱导肝纤维化大鼠模 型的miRNA调节基因芯片后，发现在CCl4诱导及胆管结扎后大
7、鼠的肝脏中miR-29家族中所 有成员均下调；此外，在细胞水平上，在大鼠HSC中过表达miR-29b引起胶原表达下调。在目前的研究中，我们发现了在E2抑制CC14诱导大鼠肝纤维化中的保护作用与雌雄大 鼠肝脏中miR-29不同表达水平之间存在相关的特点，并发现在经4周CC14处理的雄性而非 雌性小鼠的肝脏中miR-29 (miR-29a和miR-29b)水平显著下降，在雄性大鼠肝脏中miR-29a 和miR-29b下调与肝纤维化加速进展密切相关，相对于雌性大鼠，雄性大鼠的胶原、a SMA 和TGF-p 1表达增加明显。我们的结果也表明E2提高了培养的大鼠肝癌细胞IAR20中 miR-29a/b表
8、达水平，同时在雌性大鼠中E2 一直较雄性大鼠保持了更高水平。进一步研究发 现用E2处理和转染表达miR-29a/b重组腺病毒提高miR-29a和miR-29b水平(Ad-miR-29a/b) 显著降低了大鼠肝脏中I型胶原和a SMA表达水平，支持E2诱导miR-29a/b对CCl4诱导大 鼠肝纤维化的保护作用。1、实验过程1.1动物模型动物培养和实验程序完全符合美国国家健康协会关于实验动物使用的指导方针并得到南 京大学医学动物保护委员会批准。本研究实用8周龄雌雄性Balb/c小鼠(购自中国南京大 学实验动物中心)。50只雄性小鼠分成5组，10只/组CCl4组:用橄榄油配成的100 mL/L C
9、C14 腹腔注射，50W次，2次/周1； E2组：腹腔注射，1 mg/kg，2次/周，同时使用CC14处理， 方法同上5, 18； Ad-对照组和Ad-miR-29a/b组：3x108/U腺病毒，尾静脉注射，2次/周， 同时使用CC14处理，方法同上19；对照组：腹腔注射橄榄油，2次/周。12只雌性小鼠分 成对照组和CC14组，6只/组，每组治疗同配对雄性小鼠处理。用CC14处理4周或8周后杀 死小鼠。肝组织用4%甲醛收集固定用作组织学检测或立即液氮冰冻和保持-80用作RNA 分离。丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)用ALT、AST试剂盒检测;E2 水平用酶联免疫吸附试验
10、(ELISA )试剂盒检测。1.2细胞培养和激活人胚胎肾细胞293 (HEK293)和鼠肝癌细胞系IAR20购自上海细胞室。细胞用含10%新生 小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM培养液于37C，5%恒温CO2培养 箱中进行培养。用胶原酶灌注小鼠肝组织中分离肝细胞后培养在完全培养基中。IAR20细胞 和分离小鼠肝细胞放在6孔板，当细胞长至约90%时，它们培养在无血清培养基中，加入 10ng/mL 重组人 TGF-P 1 或 100nM E2 培养 48h20。1.3重组腺病毒构建及细胞感染表达miR-29a/b重组腺病毒由PCR检测(如图Fig 1)。所有miRNA前
11、体系列扩增引物 如下： miR-29a 正链，5-GACGGTACCTGGTGGAGAACAACTTCG3;miR-29a 负链, 5-CAGAAGCTTCATCAAACCTTCAATCCG3;miR-29b正链，5-ACCAGATCTGCGTCACGGCTCAATGTC-3; miR-29b 负链,5-AGGCTCGAGCAGGCTTGATGGAGTCTGC-3。片段克隆入载体Ad Track-巨细胞病毒(pAdTrack-CMV)21。表达 miRNA 的重组载体 PCMV 分为 pCMV-miR-29a、 pCMV-miR-29b、pCMV-contro1。插入序列均由核苷酸测序证实。过
12、程22如下：重组载体与 PmeI连接，经电穿孔共转导结合到腺病毒质粒pAdEasy-1，最后导入大肠杆菌BJ5183。重组 腺病毒质粒由同源性重组合成;选择阳性株并扩增以制备DNA抽提，然后用PacI消化DNA； 腺病毒质粒(pAd-miR-29a, pAd-miR-29a,pAd-contro1)与PacI连接，用酒精沉淀净化，然后转 导入HEK293装入一 25cm2培养瓶中。用20u1脂质体2000连接4曲质粒DNA并监测绿色 荧光蛋白(GFP)表达23。在转染12天后，收集细胞并离心10min，500g/min。然后3或4 个循环在干冰中冰冻和37 C融化以从细胞中释放出病毒，收集Ad
13、-miR-29a、Ad-miR-29b、 Ad-contro1，然后扩增和用腺病毒病毒纯化试剂盒纯化，实时定量PCR检测miR-29a/b水 平22。用孔板形成实验检测HEK293细胞中腺病毒滴度。感染复数为总孔板形成单位与感 染细胞总数比率19。纯化病毒滴度为3.0x108PFU/m1。正如附图Fig 1描述，纯化病毒成功 感染细胞并表达miR-29a/b。所有病毒储存在-80C。1.4组织病理检查和免疫组化形态学研究方法：肝组织保存在4%甲醛中，嵌入石蜡并切成5um厚切片。一些切片按 说明书用天狼星红染色24, 25。肝纤维化组织学定量评估用NIH成像软件测天狼星红阳性 面积26。其他组织
14、切片用甲苯和酒精递减冲洗。用免疫组化检测a SMA、I型胶原、TGF- P 1，简单地说，就是在37C用山羊血清阻断后，然后在4C用3种纤维化标志物蛋白抗 体培育1夜，用PBS冲洗3次，然后在37C用生物标记的抗兔二次抗体培育30min，再用 3, 3-二氨基苯胺-H2O2染色，在用苏木精复燃，最后在光镜下检测。1.5寡核昔酸和转染表达小鼠NF-k B基因转录激活的pBD-NF-K B购自试剂盒。抗iK Ba或NF-k B p65 的siRNA单核昔酸链购自基因制药生物技术公司。转染前24h IAR20细胞密度为1X106。 按说明书用脂质体 2000 把 iK Ba siRNA、NF-k B
15、 p65 siRNA、negative control (NC siRNA) 转染如细胞。不管是否有 E2，用 24ug pBD-NF-K bhuo pCMV-control (control)/106 细胞 使NF-k B过表达。在转染后48h收集总RNA和蛋白，以用于分析iK Ba、NF-k B p65、 miR-29a/b 表达。1.6定量实时PCR用Trizol试剂盒从肝组织抽提总RNA(2ug)，然后按照说明书用AMV逆转录试剂盒把RNA 逆转录成20ul cDNA。在应用生物测序系统7300上用2ul cDNA样本经实时PCR检测。用于 a SMA、I型胶原、TGF- p 1 mR
16、NA定量的正反引物序列如下：TGF-p 1正链， ATCCCGCCCACTTTCTAC;TGF-p 1 负链 ，AGTTCAAT CCGCTGCTCG;a -SMA 正 链 ， TCGGATACTTCACGTCAGGA;a -SMA 负 链 ，GTCCCAGACATCGGGAGTAA;Col1a1 正 链,GCTCCTCTTAGGGGCCACT; Col1a1 负链，CCACGTCTCACCATTGGGG; P -actin 正链， GAGACCTTCAACACCCCAGC; P -actin 负链，ATGTCACGCACGATTTCCC。反应条件：95C 5 min 95C 15s, 58C30s, 72Cfor 30s， 40 循环。熔点曲线分析是 90C (TGFP 1), 85C (a -SMA and Collal) or 88C
