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1、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA) 检测及临床意义间接荧光免疫(IIF)方法(欧盟)一、 ANCA 概念及分类抗中性粒细胞胞浆抗体是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成份为靶抗原的自身抗体，对系统性血管炎炎症性肠病等多种疾病的诊断和鉴别诊断具有重要的意义，已成为自身免疫性疾病的一项非常重要的常规检测项目。目前，已经有十余种中性粒细胞胞浆成分被证实为 ANCA 的靶抗原，蛋白酶3(PR3),髓过氧化物酶(MPO),人白细胞弹性蛋白酶(HEL),乳铁蛋白(LF),组织 蛋白酶G(Cath G),杀菌/通透性增强蛋白(BPI),人溶酶体相关膜蛋白2 (H-LAMP2), 溶菌素(LYS) ，天青杀素，防御
2、素，烯醇化酶，葡萄糖醛酸酶。根据乙醇固定的中性粒细胞基质片中，可以区分两种不同的荧光模型：一种胞浆型(c-ANCA ) ， 是均匀分布在整个中性粒细胞胞浆中的颗粒型荧光，细胞核无荧光。在乙醇和甲醛固定的中性粒细胞片中，其荧光模型表现相同。其主要的靶抗原是蛋白酶3(PR3)。另一种是核周型(p-ANCA ) ， 是围绕中性粒细胞细胞核周围的平滑带状荧光。由多种抗原引起， 主要靶抗原是髓过氧化物酶(MPO) ， 人白细胞弹性蛋白酶(HEL) ，乳铁蛋白 (LF) ， 组织蛋白酶G(Cath G)， 杀菌 /通透性增强蛋白(BPI) ， 人溶酶体相关膜蛋白2 (H-LAMP2),溶菌素(LYS)等。
3、不同抗体在乙醇和甲醛固定的中性粒细胞片中， 其荧光模型表现有所不同。 抗 MPO 抗体产生的 p-ANCA 因耐甲醛， 其荧光模型与在乙醇固定的中性粒细胞中出现的 c-ANCA 类似故叫甲醛抗性的 p-ANCA 。而其他非 MPO 抗体不与甲醛固定的中性粒细胞反应， 无荧光表现， 这种类型又称为甲醛敏感的 p-ANCA 。故根据乙醇和甲醛固定的中性粒细胞片表现，可初步判定ANCA的靶抗原PR3, MPO,非MPO三类。二、 ANCA 的检测间接荧光免疫方法是检测 ANCA 的参考方法或者标准方法，至今也是最常用的经典方法。IIF是区分c-ANCA和p-ANCA的基础，有较高敏感性，可半定量，
4、但IIF测定的是总ANCA,不能准确区分靶抗原，需特异性的检测方法作为补充。由于多种免疫性疾病患者存在 ANA ,用IIF法检测ANCA时，会产生干扰实验结 果的判断。为避免干扰现象，采用了四基质联合的检测即：乙醇固定的粒细胞； 甲醛固定的粒细胞；Hep-2 （人喉癌细胞）细胞；猴肝细胞。基质片各细胞分布及 意义如表一所述。ANCA荧光模型及表现如表二所述。表一：四联基质片分布及意义区分ANA的干扰：Hep-2细胞有 典型荧光表现，Hep-2 细胞甲醛固定 粒细胞1:判断c-ANCA ,2:区分 p-ANCA对甲 醛敏感还是耐受甲醛抗性p-ANCA :抗MPO抗体耐甲醛，具荧光与在乙醇固定的中
5、性粒细胞中的 c-ANCA类似甲醛敏感p-ANCA :其他非MPO抗体不与甲醛固定的中性粒细胞 反应，无荧光表现区分ANA与ANCA :借助猴肝细 胞和其中的肝血窦粒细胞。ANCA阳性，只有肝血窦粒细胞出 现荧光，。如果两者同时阳性，所 有肝细胞核都后荧光。猴肝 细胞乙醇固定 粒细胞是标准实验基质。区分两种荧光模型：c-ANCA ; p-ANCA。表二：ANCA荧光模型及表现荧光模型荧 光 表 现乙醇固定粒细胞甲醛固定粒细胞Hep-2细胞猴肝细胞ANA 阴 性c-ANCA阳性胞质呈现弥散的细颗 粒荧光，胞质荧光清 晰勾勒出核的轮廓， 分页核之间荧光增 强。胞质呈现弥散的细颗 粒荧光，胞质荧光清
6、 晰勾勒出核的轮廓， 分页核之间荧光增 强。阴性肝细胞本身无荧光。仅肝血窦粒细胞出现火儿。p-ANCA阳性甲醛 耐受p-AN CA呈现核周胞质平滑丝 状带荧光。荧光阳性 的胞质主要集中在分 页核周围，形成环状 或小规则的块状。胞质呈现弥散的细颗 粒荧光，胞质荧光清 晰勾勒出核的轮廓， 分页核之间荧光增 强。阴性肝脏细胞本身无荧光。仅肝血窦粒细胞出现 火儿。甲醛 敏感p-AN CA呈现核周胞质平滑丝 状带荧光。荧光阳性 的胞质主要集中在分 页核周围，形成环状 或小规则的块状。阴性阴性肝脏细胞本身无荧光。仅肝血窦粒细胞出现 火儿。ANAANCA阴性细胞核阳性，荧光强 度增强阴性细胞核呈现 荧光表现
7、，如ANA所述肝细胞核阳性。肝血窦粒细胞未见荧 光。阳 性甲醛耐受p-ANCA阳性细胞核阳性，荧光强 度增强荧光表现如c-ANCA阳性，乙醇，甲醛固 定粒细胞所述细胞核呈现 荧光表现，如 ANA所述。肝细胞和肝血窦粒细 胞都后安）C。甲醛敏感p-ANCA阳性细胞核阳性，荧光强 度增强阴性细胞核呈现 荧光表现，如 ANA所述。肝细胞和肝血窦粒细 胞都后安）C。三、注意事项为提高对疾病诊断的特异性，检测时应注意以下问题1、检测ANCA, 一般建议同时做IIF初筛和确认实验，以提高 ANCA的临床应用 价值，不做单独初筛或单独确认实验，以免降低对疾病诊断的特异性。2、不能仅检测抗PR3和MPO两种特
8、异性抗体，而不检测，这样容易限制 ANCA 对疾病诊断的特异性。3、用IIF检测时，仅使用乙醇固定的粒细胞片，这样不能严格排除ANA的干扰，容易出现假阳性。四、临床意义（一）ANCA与原发性小血管炎韦格纳肉芽肿（WG）,显微多动脉炎（MPA）,坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN） 和变应性肉芽肿性血管炎（CSS）等等原发性系统性小血管炎的发病与 ANCA密切 相关，临床上已将上述疾病统称为 ANCA相关小血管炎。ANCA,特异性PR3抗体 和抗MPO抗体的检测已成为原发性小血管炎的敏感特异的血清学检测项目。1、抗PR3抗体特异性PR3抗体为WG的标志性抗体，抗PR3抗体荧光模型以c-ANCA为
9、主。 但以c-ANCA诊断WG特异fi为90%,而以抗PR3抗体的特异性可超过95%。 抗PR3抗体在其他的原发性血管炎中业可以检测出来，但阳性率较低。抗PR3抗体敏感度与疾病的活动性及病程有关， 在疾病的早期症状不明显时，就可出现阳性。因而抗PR3抗体常作为WG的早期诊断、疗效判断、复发估计的指标，对临床治疗有重要的参考价值2、抗MPO抗体抗MPO抗体荧光模型以p-ANCA为主，主要与 MPA、NCGN、CSS相关。还可见于其他疾病，如节结性多动脉炎，抗肾小球基底膜肾病， WG, SLE, RA, 药物诱导的狼疮，Felty综合症等。抗体滴度与疾病活动性相关，可用于早期诊断、 疗效判断、复发
10、估计的指标，对临床治疗有重要的参考价值。抗MPO抗体阳性高度提示坏死性血管炎或特发性 NCGN，对诊断原发性小血 管炎的特异性达到99%。因而每一个不明原因的血管炎或肾小球肾炎的患者，都 应该检测ANCA。表三：ANCA与原发性小血管炎相关疾病荧光模型靶抗原（）韦格纳肉芽肿（WG）C , P （少见）PR3 (85), MPO (10)显微多动脉炎（MPA）C , PPR3 (45), MPO (45)坏死性新月体性肾小球肾炎（NCGN）C , P （少见）PR3 (25), MPO (65)变应性肉芽肿性血管炎（CSS）C , P （少见）PR3 (10), MPO (60)结节性多动脉炎（
11、PAN）少见PR3 ，MPO (15)抗肾小球基底膜病（抗 GBN）PMPO（二）ANCA与药物诱导性血管炎近年来不断有药物治疗引起的 ANCA阳性的病例报道，如丙基硫氧喀咤，月井 苯哒嗪，普鲁卡因酰胺，青酶胺，美满霉素，他巴噪 /甲航咪噪等。其中报道比较 多的是长期使用丙基硫氧喀咤引起的ANCA,其特点是滴度高，抗体谱广（抗原主要是MPO,也可同时伴有或单独出现其他靶抗原，如 PR3, LF, Cath G, BPI, LYS 等）。药物诱导性血管炎患者临床表现与原发性血管炎类似，停止丙基硫氧嘧啶用药后，临床症状好转， ANCA 可转阴。因此，长期使用丙基硫氧嘧啶治疗过程中， 应定期检测 A
12、NCA ，及早发现药物诱导性血管炎。（三） ANCA 与其他疾病除原发性血管炎外，其他一些疾病中也可出现ANCA ，主要为p-ANCA ，其靶抗原并非PR, MPO,而是LF, Cath G, BPI, LYS等1 、慢性炎症性肠病（CIBD）CIBD 是一种消化系统的自身免疫性疾病，包括溃疡性结肠炎（UC） ，克罗恩病（CD）两种。以往的CIBD诊断依赖X线检查，内窥镜及组织学诊断，缺乏有效的试验室指标。 近年来研究发现UC 病人血清中 ANCA 阳性率为60-80， 而CD 患者的阳性率为10-20，多为p-ANCA ，相关靶抗原有BPI 等。滴度与疾病的活动度和病程无关。因为 p-ANC
13、A 在 UC 阳性率高， CD 阳性率低，故可作为两者的鉴别诊断及UC 早期诊断指标。2、结缔组织病在结缔组织病中， ANCA 阳性主要见于SLE 和 RA ， 其他结缔组织病中少见。但文献报道在SLE 和 RA 阳性率差异特别大（16-69） ，这可能与使用方法，抗原基质片及工作人员水平有很大关系。SLE中ANCA阳性可能与慢性炎症反应有关，如动脉炎，浆膜炎和CRP增加等。有报道抗MPO 抗体与 RA 的关节外损害及血管损害有关。3、自身免疫性肝病在自身免疫性肝病中，也可检测到 p-ANCA 。在原发性硬化性胆管炎（PSC）患者中， p-ANCA 阳性率高达70-80，是该病重要的血清学指标。4、其他疾病有文献报道，HIV,阿米巴，细菌感染以及不明原因的肺部慢性炎症及纤维化患者中有 p-ANCA 阳性。
