酶标抗体技术

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1、【最新整理，下载后即可编辑】酶标抗体制备技术基本要求是将酶分子与抗体或抗抗体分子 共价结合，此种结合既不改变抗体的免疫反应活性，也不影响酶 的生物化学活性。用于标记抗体的酶较多，常用的有辣根过氧化 物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和P-半乳糖昔酶等。（一）辣根过氧化物酶标抗体制备技术辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase , HRP）广泛分 布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深 棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖 18%）。此酶溶 于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。HRP分子量较小（40kDa），标记物容易穿透入细胞内部； 作用底物为H2O2，以二氨

2、基联苯胺（DAB）为供氢体的反应 产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察；在 pH3.512范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能 耐受63C加热15min ；用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙 醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性；溶解性 好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱 和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯 化；氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对 HRP的活性 有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以 防止失活。凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成 有色产物的化合物（供氢体）都可以用显色

3、剂。供氢体的产 物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为 3,3 二氨基联 苯胺（3,3diaminobenzidine,DAB），适用于免疫组化法；反应 后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物； 这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的 产物，适用电镜检查；此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产 物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用 的为邻苯二胺（O-phenylene diamine,OPD），产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别；易被浓酸 终止反应，颜色可数小时不变，是 ELISA中最常用的一种； 但对光敏感，使用时要避光，并发

4、现有致癌作用。用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体 分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛 （glutaraldehyde,CHO-（CH2）3-CHO）。1、改良过碘酸钠法HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛 基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨 基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2, 4-二硝基氟苯 （DNFB）封闭酶蛋白中残存的a-和-氨基。酶与抗体的结合 反应后，再加入硼氢化钠（NaHB4 ）还原成稳定的结合物。标记步骤（1）取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2 , 4而二 硝基氟苯（DNFB）无水乙醇溶液O.lmL，室

5、温（20C ）下 轻微搅拌作用1ho（2）加入1mL 0.06mol/L NaIO4 ,室温下避光轻搅30min , 溶液呈黄绿色。（3）加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温（20C）下轻 搅作用1 h,终止氧化反应。（4）加入5mg抗体（Ig），装入透析袋，置0.05mol/L , pH9.6碳酸盐缓冲液（无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏 水加至1 000 mL） 1 000 mL中，4C透析过夜，更换3次。（5）取出透析袋中液体（约3 mL）,加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4C 2h 或过夜。（6）加50%饱和硫酸铵（NH4） 2SO4溶液（硫酸铵850g, 蒸

6、馏水加至1 000 mL,以30%氨水调pH7.2） 6 mL沉淀结合 物，置 4C30min 后，3 000r/min 离心 30min，取深沉（SPA 不需要进行此步）。（7）将沉淀物溶于PBS （0.02M pH7.4 ）中，装入透析袋， 并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。（8）在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或 加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装（或冻干，不 需加甘油），低温保存备用。2、戊二醛交联法戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个 醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成 HRP-戊二醛 -Ab蛋白结合物。反应可在4-40C温度范围

7、，pH6.08.0的 缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将 酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二 醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结 过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。标记步骤（1）取 10mgHRP 溶于 0.2 mL1.25% 戊二醛（用 0.01mol/L、 pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%），室温（20C左右）反 应结合18h。（2）用 0.15mol/LNaCl 平衡过的 Sephadex G-50 凝胶柱洗 脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L, pH7.2PBS,4C透 析过夜。（3）将 5m

8、g 抗体 IgG 溶于 1mL0.15mol/L NaCl，再与醛 化HRP溶液（10mg/mL）混合。（4）加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液（调节pH 至9.09.6）,4C，电磁搅拌下结合24h。（5）加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸（0.29g溶于10mL蒸馏 水），4C放置2h,以封闭残留的醛基，终止反应。（6）装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS ,4C透析过 夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集 第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分 装，4C或-20C保存。(二) 过氧化物酶简介抗过氧化物复合

9、物制备技术Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物 酶复合物(peroxidase-antiperoxidase,PAP )法，此法也称为非 标记抗体酶法(unlabelled antibody enzymemethod )。PAP 法 不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反 应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。标记步骤(1) 取 5mL 抗 HRP 血清，16 000r/min 4C 离心 20min , 取上清液。(2) 加入 1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温(20C 土) 静置1h, 16 000r/min ,4C离心20min，取

10、沉淀物。(3) 加冷生理盐水反复洗涤-离心(16 000r/min ,4C离 心20min ) 3次，弃上清，取沉淀物。(4) 加入过量HRP溶液4mL (2mg/mL)混匀后，移至 小烧杯内。(5) 在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl 调至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。(6) 立即加入 0.01mol/LnaOH,调 pH7.4 ,16 000r/min , 4C 离心20min，取上清液。(7) 加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L 醋酸铵的等量混合液后混匀。(8) 电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续 搅拌 10min,4

11、C 放置 20min , 16 000r/min , 4C 离心 20min , 去上清，取深沉物。(9) 以 50%饱和硫酸铵洗涤，4C、16 000r/minX20min, 离心2次，取深沉物。(10) 加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用 Ph6.75醋酸盐缓冲液(13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75mL 1.5mol/L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵)4C透析3d, 每天换液2次。(11) 17 OOOr/min ,4C离心20min，取上清液进行工作 效价鉴定。(12) 加等量60%甘油，小量分装，-20C保存。(三) McAb-PAP制备技术用抗HRP McAb制

12、备PAP复合物的工艺条件较为简便， 而且不需严格的条件限制。用小鼠抗HRP McAb制备的腹水， 按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37C水浴反应2h,即 成鼠PAP复合物。以按HRP/IgG克分子比为4 : 1制备为宜。(四) 碱性磷酸酶标抗体制备技术简介碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , AP),系小牛肠粘膜 和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功 酶组成。从小牛肠粘膜提取的 AP分子量为100kDa,酶作用 的最适pH为9.6；从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa,最 适pH为8.0。它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本 磷酸盐(PNP)、卩-

13、甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作 双标记染色，研究递质共存及酶名疫测定。AP标记抗体，一 般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别 与戊二醛的两个醛基结合。标记步骤(1) 取抗体(25mg/mL) 1mL,加入AP 5mg溶解。(2) 装入透析袋，用 0.01mol/L、Ph7.2PBS4C透析 18h, 换液3次。（3）加入2.5%戊二醛20uL，室温（20C ）放置2h。 4C0.01mol/L、pH7.2PBS 透析过夜，换液 3 次。（4）移入 0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl 缓冲液中，4C透析 过夜，换液3次。（5）取出标记抗体，用含%BSA和0.02

14、%NaN3的Tris-HCl 缓冲液稀释至4mL,即为酶标记物原液。（6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（O.ImL） 分装，4C保存（使用前以pH7.4PBS -吐温溶液将结合物适当 稀释）。（五）碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物制备技术Mason等（1978），用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立 了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）桥联酶标技术。 但以 AP 作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到 APAPP 桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项 技术的推广使用。杨志刚等（ 1989）利用抗 AP 的 McAb 建立 了一种制备 APAAP 复合物的简便方法。只需将 AP 和抗 AP 的McAb以适当比例混合，4C结合过夜即可使用。采用改良 的 ELISA 方法检测 APAAP 复合中 AP 的最适含量。具体方法 是：用羊抗鼠 Ig 包被微量滴定板； 加入一定量的抗 APMcAb ； 分别加入不同量的 AP 作用后经过洗涤；加底物显色，测定光 密度值（ OD） 。在一定范围内， APAAP 复合物溶液中 AP 含 量增加的同时， 相应的 OD 值也随之增大；当 AP 增加到一定 量时（约68mg/mL）、OD值保持稳定。