铜绿假单胞菌感染和耐药机制

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1、铜绿假单胞菌感染和耐药机制铜绿假单胞菌是革兰氏阴性杆菌， 是条件致病菌， 它对健康 的机体 几乎不会引起感染， 但是对免疫受损的机体可以引起严重 的感染，免疫受 损的机体包括囊性纤维化患者，癌症病人，艾滋 病毒感染者，严重烧伤病 人 1 。由于传统的抗生素治疗，使铜 绿假单胞菌对许多抗生素产生了严 重的耐药性， 它可以产生各种 灭活酶或修饰酶 , 如内酰胺酶等 ; 菌体蛋白 结构和功能改变逃 避抗菌药物作用 ; 膜屏障与主动排外 ; 形成生物保护膜 等 4 ，来 抵制抗生素的作用。 这也是在临床上很棘手的问题， 使铜绿 假单 胞菌不仅成为难以治疗的病原菌， 也使其成为众多研究细菌致病 性 和耐

2、药性的对象。首先来了解一下铜绿假单胞菌引起的常见的 感染和疾病。1、铜绿假单胞菌引起的常见的感染和疾病 在临床上发现呼吸科和烧 伤科铜绿假单胞菌感染率和检出 率较高。1.1 铜绿假单胞菌相关性肺炎 它包括慢性阻塞性肺疾病(COPD),医院获得性肺炎(CAP，呼吸机相关性肺炎(VAP),气管镜相关 性肺炎，囊性纤维变性(CF等。慢性阻塞性肺疾病 ( COPD) 慢性阻塞性肺疾病 ( COPD) 是以感染为 主要表现的疾病 , 由于其呼吸道防御功能下降 , 支气管清除能力减弱 , 故 能引起 多种细菌的感染，铜绿假单胞菌感染是 COPD 病人急性加重的主 要 原因。铜绿假单胞菌一开始就被认为是引起

3、慢性阻塞性肺疾病 (COPD 的重 要的致病菌10 , Laura 的研究证明铜绿假单胞菌 引起 COP 爾人的慢性感染11。医院获得性肺炎( CAP) 铜绿假单胞菌在社区获得性肺炎中不常见， 但在医院获得性肺炎(CAP中较常见的病原菌之一 2。CAP是COPD常 见并发 症和重要死亡原因之一，近年来国内关于 COPD 患者合并 CAP 方 面的研究得到广泛关注。 同时由于社会人口的老龄化、 免疫损 害宿主增 加、 病原菌变迁和抗菌药物耐药率上升等原因 , 其致病 菌的组成和耐药特 性在不同国家、 不同地区之间存在着明显差异 而且随着时间的推移而不断 变迁 6 。呼吸机相关性肺炎 ( VAP)

4、机械通气已成为重症监护病房 ( ICU ) 救治呼吸衰竭患者的 重要手段 , 随之而来的呼吸机相关性肺炎 ( VAP) 日益受到人们 的重视。铜绿假单胞 菌已成为 VAP 的主要致病菌 , 其具有多药 耐药性 , 治疗难度大 , 病死率 高。 由于铜绿假单胞菌在医院环境 中广泛分布 , 常见于医务人员的手、病 床、桌面、呼吸机管路、 各种医用导管及医疗用品的表面等 , 使得机械通 气患者成为铜 绿假单胞菌感染的易感人群。 该菌所致的感染大多发生在免 疫功能低下且伴有严重基础疾病的患者，如高龄 COPD患者脑外伤或脑血管意外患者 , 较大创伤对自身免疫力的削弱以及气管 插管或气管切开 机械通气

5、留置导尿等侵入性操作 , 均使感染 的机会 大大增加 5 。1.2 烧烫伤后感染 烧烫伤患者严重感染已成为影响其健康 甚至导致死亡的重 要原因 之一， 30 年来感染一直占据死亡原因的首位 12 ，烧伤 后的感染是一个 很重要的问题， 因为一旦感染上医院获得性的多 重耐药性细菌， 将是一 个很麻烦的事情。 在烧伤感染细菌菌种多 以革兰阴性杆菌为主 , 其中以铜 绿假单胞菌的检出率最高。 各地 报道显示 , 该菌的检出率牢牢占据革兰阴 性杆菌的首位 13-14 , 成为烧伤创面感染常见细菌之一。铜绿假单胞菌适 应 性很强， 它对不少抗生素有天然耐药性， 这使得它可以定植在烧 伤部 位并可以快速增

6、殖， 而这种局部的增殖可以导致全身的脓毒 血症，而脓毒 血症又可导致高的死亡率。 15这些疾病在临床上一旦出现非常棘手， 因为铜绿假单胞菌适 应性很 强，它对不少抗生素有天然耐药性和后天获得的多重高度 耐药性，临床治 疗十分困难 ,一旦感染 ,病死率很高。2. 耐药机制铜绿假单胞菌耐药机制相当复杂 , 已知的主要有 : (1) 青 霉素结合蛋 白 ( PBPs) 结构和功能的改变以及与抗菌药物亲和 力的下降。 (2)外膜通 透性降低。(3) B -内酰胺酶的产生。(4) 氨基糖苷类修饰酶的产生。 (5) 细 胞外膜主动外排系统的表达。 另外 (6) 铜绿假单胞菌生物膜的形成也使其 对抗菌药物不

7、敏感62.1 细胞外膜主动外排系统 铜绿假单胞菌外排泵是由相同的操纵子所 编码的内膜转运体(如MexB MexD MexF MexY Mexl和MexW和MFP 以及由 相同的操纵子或染色体其他区域的基因所编码的 0M 蛋白共同形 成的一种贯穿内外膜的通道， 该通道能够直接将靶物质从细胞质 泵至细胞 外环境。铜绿假单胞菌外排系统包括 MexAB-OprM 型和 MexCD-OprJ 型，主导致菌株获得性的对多种药物耐药的原因是MexAB-OprM的过度表达。主动外排系统MexAB-OprM的高表达对美罗 培南的耐药起重要作用，其高表达与调控基因mexR 变异有关，MexAB-OprM高表达的分

8、子机制可能与泵调节基因MexR的突变以及其他突变型有关17， MexAB-OprM 主动外排系统表达 水平 的增高与PA多药耐药的形成密切相关18-19。2.2 B -内酰胺酶的产生，铜绿假单胞菌产生三种B-内酰胺酶，包括超广谱B-内酰胺酶(ESBL),诱导酶(AmpC酶)，金属p -内酰胺酶。其中金属P-内酰胺 酶可以水解亚胺培南， 导致其耐药， 而亚胺培南被认 为是治疗铜绿假单胞 菌等感染的重要武器，目前发现的获得性金属P -内酰胺酶包括：IMP、VIM、GIM SPM4 种，其中以 IMP 和 VIM 常见，IMP-7 ( GenBankAF318077) 其产生菌对美洛培南和 亚胺培南

9、高度耐药 24 。产 ESBLs 不易被忽视 , 国外报道铜绿 假单胞菌产超广谱 p -内酰胺酶( ESBLs ) 的检出类型已达150余种，其中，以OXA型增长最快，OXA-5O在铜绿 假单胞菌的表 达可降低氨苄西林、替卡西林、拉氧头孢和美洛培南的敏感 性 20 。国内徐卫等报道在铜绿假单胞菌中 , ESBLs 的检出率已高 达38-23% 21-23 。有文献报道，铜绿假单胞菌染色体固有携 带 ampC 基 因，但基因的表达受诱导剂(抗生素)调节，促使 AmpC 酶的产生， 一 旦去除抗生素， 大多数情况下产酶水平水逐渐恢复 到基线水平28。但当 ampC 基因自发突变可致稳定的去阻遏表

10、达而产生持续性的高水平酶 292.3 外膜通透性降低OprD2 蛋白形成的特异性孔道 , 可以促使碳青霉烯类抗菌 药物进入 铜绿假单胞菌细胞内部 , oprD2 基因的缺少或者不表 达会导致碳青霉烯类 抗菌药物 (除美罗培南外) 对铜绿假单胞菌 不起作用 25 。衣美英等 16 测定该院 SICU 分离的 49 株 PA， 其结果显示 : 对碳青霉烯耐药主要是 由外膜蛋白 OprD 表达降低 或缺失引起，与 IMP、VIM 金属酶无关。邹 德胜等 26 通过对 26 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌进行 oprD2 基因的 PCR 扩增， 显示 其中有 20 株为膜孔蛋白 oprD2 基因缺失。这一结

11、果说明 oprD2 基因的缺失应该是亚胺培南对铜绿假单胞菌不起作用的主要原 因 27 。2.3 氨基糖苷类修饰酶与 16SrRNA 甲基化酶的产生酶修饰是氨基糖苷类抗生素最常见的耐药机制， 经酶修饰的 抗生素 与细菌 16SrRNA 上的 A 位点的结合力下降，从而导致药 物抗菌活性的丧失 31 。依据其修饰功能的不同可分为 3 类， 即氨基糖 苷磷酸转移酶 ( aminoglycoside phosphotransferases ， APH) 、氨基糖 苷乙酰转移酶 ( Aminoglycoside acetyltransferases ， AAC) 和氨基糖 苷类核 苷转移酶 ( amin

12、oglycoside nucleotidyltransferases，ANT)32 。铜绿假单胞菌具有编码这 3 类修饰酶的基因 33 。16SrRNA 甲基化酶是近年来发现的一种新的由质粒介导的 耐药机制 与临床上常见的氨基糖苷类修饰酶不同， 氨基糖苷类 修饰酶具有底物特异性， 因此， 细菌同时对多种氨基糖苷类抗生 素产生持续耐药比较少见， 而 甲基化酶修饰的是所有氨基糖苷类 共同的作用位点， 一旦修饰发生， 目 前使用的一切氨基糖苷类抗 生素都将失去作用，并且耐药菌的 MIC 往往高 达 512 1024 mg /L 。这种新的耐药机制的出现，打破了以往的认识，微 生物学家 们惊呼“前所未

13、有的”危险的氨基糖苷类耐药菌株不久将在全 球播散， 必须引起临床高度关注。 2002 年，日本学者 Yokoyama 等对 1 株 分离自 1997 年的铜绿假单胞菌的研究中， 发现其对阿 贝卡星（卡那霉素 的衍生物）高度耐药，介导铜绿假单胞菌对阿 贝卡星高度耐药的是这种新的 氨基糖苷类耐药机制一一 16SrRNA甲基化酶，（RmtA）,并且该酶的编码 基因和超广谱B -内酰胺酶 CTX-M-3 编码基因位于同一接合性质粒上 30 。2.4 铜绿假单胞菌生物膜的形成 生物被膜是细菌为适应自然环境而形成的， 系指细菌吸附于 生物材料或机体腔道表面， 分泌多糖基质、 纤维蛋白、 脂蛋白等， 将其

14、自身包绕其中形成的膜样物 36 。铜绿假单胞菌为临床产生 细菌生物被膜 相关感染最常见的致病菌 , 铜绿假单胞菌在体内粘 膜、各种插管、病房物表等上形成的生物膜 , 这与铜绿假单胞菌 引起的感染 , 特别是肺部感染 , 很 难被清除 , 常常导致感染的反 复发作有很大的关系。 铜绿假单胞菌在湿润环境下 , 浮游细菌可 吸附于体的表面 , 形成微菌落 , 并合成分泌大量胞外多糖基 质 , 进而微菌落分化为由胞外多糖包裹的成熟生物膜 34 。粘液 型铜绿假单胞菌，其主要成份藻酸盐是形成生物被膜的重要基 础，藻酸盐 使细菌牢固粘附于肺上皮表面形成生物被膜， 一方面 可抵御单核巨噬细 胞的吞噬作用，

15、另一方面可抵制抗菌药物的 杀灭作用 37 。而非粘液型 的铜绿假单胞菌在渗透压高、 氯化钠 较多、磷酸盐少的条件下，容易转化 为粘液型 38 。铜绿假单胞 菌生物被膜的形成是难治性肺部感染的重要原 因， 死后肺组织的 电镜分析亦显示铜绿假单胞菌在患者的肺部形成微菌落 39 。3. 药物研究3.1 抑制铜绿假单胞菌主动外排 铜绿假单胞菌广泛耐药的主要原因是 主动外排系统， 而解决 其广泛耐药的重要措施是抑制主动外排 但是许 多在体外活性 良好的外排泵抑制剂由于安全性、 特异性、 机制明确性等 诸多问 题并未能像 B -内酰胺酶抑制剂在临床广泛应用.但我们相信通 过 对各种抑制外排方法的研究， 尤

16、其是对基因靶向干预治疗研究 的不断深入和发展， 可以在不久的将来较好地解决多药外排介导 的抗菌药 物耐药问题，并取得较为理想的效果。3.2 干扰 QS 系统QS( quor um sensing) 是具有进化优势的 BF 信息传导机 制, 代表了 细菌为控制能感应自身密度的特殊基因而专用的一 种信息交流系统 , 干扰 和破坏 QS 是从基因分子水平防治生物膜 的研究热点。研究发现铜绿假单 胞菌生物被膜 QS 的抑制物可以 抑制生物被膜的形成。 Kim 等35 通过 模拟呋喃酮的结构 , 合成 一系列的 5- 氧-2, 5 二氢呋喃 -3- 烃基类似物 , 这 些合成物抑 制 QS 的程度从 20%-90%F 等，进而抑制生物被膜的形成。 实验 前模型中预测的 QS 受体