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1、固定化酵母菌在黄酒酿造中的应用摘要:本文通过比较酵母菌的不同固定化方法，以及固定化酵母菌与游离酵母菌的小型发酵实验、耐高温、耐酒精、耐高渗等对比实验来探索固定化酵母菌 在黄酒发酵中的应用,得出以下结论: 1 最佳固定化方法是海藻酸钙包埋法,其最 佳条件是海藻酸钠浓度是3%;CaC12浓度是3%;颗粒直径是1mm;包埋量是2.4 X 107个/ml;2.包埋酵母菌比游离酵母菌更利于黄酒的发酵;3.包埋酵母菌比游离酵 母菌耐高温、耐酒精、耐高渗。关 键 词: 黄酒 酿造 酵母菌 固定化The application of the immobilized Yeast in Chinese Rice
2、Wine FermentationAbstract: Different immobilized methods was compared in small scaled fermentation and thermal resistent ,alcohol-tolerant and osmophilic was determined .Study the application of the immobilized yeast in Chinese rice wine fermentation. The conclusions as follows:1.The best conditions
3、 were 3% alginate sodium ;3%CaCl2;1mm diameter;2.4X107 yeast/ml .2 the immobilized Yeast was better than the free Yeastin Chinese rice wine fermentation.3. thermal resistent ,alcohol-tolerant and osmophilic of the immobilized Yeast was better than the free Yeast.Key words: Chinese rice winefermentat
4、ion Yeastimmobilized亡 A前言:生物固定化是现代生物工程领域中的一种新技术 ,是使生物催化剂 （酶,微生 物,细胞动植物细胞,细胞器等）更广泛更有效使用的一种重要手段 ,生物催化剂通 过物理或化学的方法固定化后,能提高细胞密度,提高酶活。从而使所产生的生化 反应速度加快。使其催化性能得以改善。使用效率大大提高 ,现在固定化生物细 胞发展到固定化植物细胞,固定化细胞器,固定化原生质体。固定化微生物分孢子 及酶与微生物,好氧微生物与厌氧微生物的联合。固定化等。其应用研究。这一 新技术对许多古老传统的生产工艺带来变革的可能。如美国利用固定化葡萄糖异 构酶或固定化菌体制造果糖，使果
5、糖年产量高达36X 105吨。在啤酒饮料工业中有 英国的 White.F.H 等人用固定化酵母菌进行连续啤酒发酵,上海工微所与华光啤 酒厂在国内首次把固定化啤酒酵母菌分批发酵投入了工业生产 ，具有低设备投资 和高生产速度之特点。同年日本麒麟公司的Onaka Toshio等人报道了固定化酵母 菌酿造啤酒的口味改进措施，这种啤酒新工艺正在逐渐完善，这一切都是固定化技 术成功地使用于改造传统工业生产的例子。使用固定化酵母菌生产蜂蜜酒。香槟 酒，葡萄酒也已有报道。日本利用固定化细胞大大缩短了清酒生产周期。由此可 见，固定化技术是现代发酵工业领域内方兴未艾的新技术革命。黄酒古称老酒，世界上最古老的酿造酒
6、之一，是中华民族的宝贵遗产。其独特的 糖化发酵并行工艺在世界酿造酒中独树一帜，黄酒的工艺品种，口味是历经千百年 历史沉积和文化锤炼才逐步形成至今独具一格的魅力和神韵。黄酒营养丰富 ，酒 精含量15%-18%左右，酒性温和，刺激性小，而氨基酸含量丰富，种类达18种之多。 人体必须氨基酸的含量最全。居各种酿造酒之首 ，黄酒的发热量高。营养成分主 要有糖肽，氨基酸等低的浸出物还有维生素 ，矿物质和微量元素等，易为人体消化 吸收，因此黄酒在国内越来越来走俏。黄酒的发源地为浙江绍兴，所以又称绍兴酒， 后来发展到浙江全省，并逐步发展到江苏，福建，江西和上海等地。如今已有 26 省 市生产，成为全国性的酒类
7、工业，这些省市生产黄酒又称为仿绍酒 ，随着需求的不 断增长，各地的黄酒产量不断提高。名优酒由 1952 年时仅一种绍兴加饭酒发展到 今已拥有 8 种国家名酒，18种国家优质酒及多种省优质酒。黄酒盛行于江南，每年 低温冬季酿造，其发酵期长达 60-80天。在发酵后期，一旦气候转暖，来不及榨酒煎 酒，就会引起酸败的危险。目前生产尚为自然条件所限，仍按原有习惯于每年立冬 （相当于阳历1 1 月上旬）开始浸米，蒸饭发酵，至立春（翌年 2月上旬）停止蒸饭酿造， 这是历来沿袭传统工艺，设备简陋，操作繁重，周期冗长，近年虽有个别的酒厂采用 机械化生产新工艺，改进旧工艺的劳动强度大，生产周期长之缺点，然而进一
8、步采 用固定化酵母菌发酵技术来进行黄酒生产至今还是个空白。1. 材料与方法1. 1 材料酵母菌:由本系微生物实验室提供酵母菌a -y麦芽汁米汁 用糯米在水中浸泡 2天,把浸泡和的糯米以 1:2 的比例加水煮开,到糯米完 全糊化为止,冷却到60C左右，加入20%的曲和适量糖化酶到糯米粥中。把糯米粥 充分搅拌均匀放入60C的恒温水浴箱中6小时,作淀粉实验至没有变化为止，然 后过滤即得糖化米汁用水和乳酸调到适当的糖度和酸度YEPD 酵母菌膏 20g水 1000 ml葡萄糖 20g蛋白膏 10g 琼脂 20g不加琼脂为液体 YEPD 糯米:由农学系提供, 品种:凡三曲 : 由黄酒厂提供糖化酶: 无锡酶
9、制剂厂化学试剂 :海藻酸钠 上海化学试剂采购站分装琼脂 ,CaCl2金坛市试剂厂戊二醛:上海振兴试剂厂试剂全部为分析纯1. 2 方法1.2.1黄酒的理化指标的测定方法(1) 外观糖度 用量筒装满酒样,将糖度计(标温 20C ,0.1 分度)轻轻放入量筒内,不 让糖度计与量筒接触,待稳定后,读出糖度。同时测定酒样温度，查附表换算成 20 C时的糖度。(2) 酒精度的测定用容量瓶取接近20C的酒样100ml，倒入250ml圆底烧瓶中，取 50ml 水,分别洗涤容量瓶,洗液并倒入圆底烧瓶中。连接冷凝装置 ,加热蒸馏. 馏出液承接于原容量瓶中,至馏出液约为95ml时，停止蒸馏，加水定容至100ml,
10、混匀后倒入100ml量筒中，用酒精计(标温20C,0.1-0.2分度)测酒精度。同时测 温度查附表换算成20C时的酒精度。(3) 真正糖度测定 上述蒸出酒精后留在烧瓶内的残留液冷却后，移入 100 容量瓶 中，用少量水，分次洗涤，并入容量瓶中，用水定容.倒入 100 量筒中，用糖度计测 定。 (同 1)挥发酯测定 吸取测定酒精度的馏出液10ml于250ml三角瓶中。加1%酚酞 指示剂2滴，用0.1N氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。再加0.1N氢氧化钠标 准溶液5ml,装置回流冷凝管，在沸水浴中回流，半小时进行皂化。冷却后准确加 入0.1N硫酸标准溶液5ml,摇匀。用0.1N氢氧化钠标准溶液滴至呈
11、微红色, 半分钟内不消失为止。其计算是挥发酯(g/L)=(5+V) XNx-5XN2X 0.088 X 1000/10a -氨基氮的测定 吸取酒样1ml于100ml的容量瓶中，加水定容到100ml,摇匀. 按下列顺序加入试剂:表1编号试剂测定管空白管标准管12甘氨酸标准溶液(ml)0022酒样稀释液(ml)2000水(ml)0200显色剂(ml)1111管口塞上玻璃球在沸水K浴中加热16分钟20C水浴中冷却20分钟稀释液(ml)555摇匀,在半小时内于 570nm 波长下测其各光密度.。计算是a -氨基氮(mg/L)=测定管光密度X2X酒样稀释倍数/标准管平均光密度2包埋酵母的活性的测定 将包
12、埋酵母菌加在一定量的生理盐水中,摇晃5分钟左右,取一定量的溶液,稀释一 定的倍数,用美兰试剂染色,再用显微镜测定其中的酵母的活菌体数 ,再除以原来 的菌体数,即得包埋酵母的活性1.2.3 不同固定化方法的比较 目前经常采用的生物固定化方法主要有吸附法,包埋法,交联法等。本实验因条件 所限采用的主要是木屑吸附法,海藻酸钠包埋法,琼脂包埋法。(1) 木屑吸附法：将木屑洗净;用5%NaOH溶液煮沸30分钟，然后用蒸纟留水洗至中 性;高压蒸汽灭菌 30 分钟;将经过预处理的木屑加入到含 50ml 麦芽汁培养基 的250ml锥形瓶中，接种2X107个酵母菌,于水浴振荡器上培养3天;滤出木屑, 用生理盐水
13、洗净，即得木屑吸附固定化微生物，备用。(2) 海藻酸钠包埋法：将海藻酸钠热溶于水,冷却; 将海藻酸钠溶液与酵母菌细胞 混合均匀,使海藻酸钠最终浓度为 3%;将海藻酸钠与酵母菌的混合溶液用针形 管滴入5%的海藻酸钠的浓度溶液中，放置2h;滤出颗粒，用生理盐水洗净备用。(1)琼脂包埋法:将琼脂加热溶于水,冷却到4550 C;使琼脂溶液与酵母菌细胞 混合均匀，琼脂的最终浓度为3%;在常温下(4550 C);将琼脂与微生物的 混合溶液用针形滴入上层是液体石蜡下层是水的量筒中 ;滤出固定化酵母菌 颗粒， 用生理盐水洗净备用。利用上述包埋固定化方法固定化酵母菌，测定其活性1.2.4不同情况下的海藻酸钠包埋
14、效果的比较在影响海藻酸钙包埋效果的诸多因素中,海藻酸钠的浓度,颗粒的直径, CaCl2 浓度,酵母菌的数量起着主要作用 ,因此本实验利用正交实验 ,其中海藻酸钠的浓 度分为1%、2%、3%;颗粒的直径分为1mm、2mm、3mm; ,CaCl2浓度分为3%、 5%、 7%;酵母菌的数量分为每 10ml 海藻酸纳和酵母菌的混合溶液中分别为 4.8 X108个、3.6X108、2.4X108个建立 L9(34)正交表格表2水平因素考察指标A海澡酸钠(%)BCaCl2 (%)C酵母数(个 /10ml)D颗粒直径(mm)酒精浓度11%3%4.8X108322%5%3.6 X 108233%7%2.4X1
15、081按照表2 的方法进行发酵比较1.2.5游离酵母与固定化酵母的比较(1) 游离酵母菌与固定化酵母菌进行小型发酵比较用糖化好的糯米米汁,用上面用正交实验的结果包埋酵母菌和游离的酵母菌 进行对比发酵实验,定时测定其理化指标进行比较。(2) 游离酵母菌与固定化酵母菌进行耐高温比较用糖化好的糯米米汁,用上面用正交实验的结果包埋酵母菌和游离的酵母菌 分别在33C、35C、37C的培养箱中进行耐高温的对比实验，定时测定其理化指 标进行比较。(3) 游离酵母菌与C固定化酵母菌进行耐糖度比较用YEPD培养基用葡萄糖按不同比例分别调成糖度为10%、20%、25%、30%、 35%、 40%用杜氏发酵管把包埋酵母菌和游离酵母菌进行对比发酵实验,定时观察 其产CO2的量，用”,”+”表示。(4) 游离酵母菌与固定化酵母菌进行耐酒精比较用糖度为12的原麦芽汁用酒精调成浓度为14%、 16%、 18%、 20%、 22%用 杜氏发酵管把固定酵母菌和游离酵母菌进行对比实验,定时观察其产 CO2 的量, 用”,”+”表示。2结果与分析2. 1 成品黄酒干黄与半干的成分比较结果如下表所示表3项目单位干黄半干总酸g/L(
