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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-dateWestern-blot-试剂配制及操作流程Western-Blot操作流程Western-Blot操作流程 试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液： 50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g 150mM NaCl 4.38g 1%TritonX-100 5ml 1%脱氧胆酸钠 5g 0.1%SDS 0.5g 蒸馏水至 500ml。 调pH值至
2、7.5。混匀后4保存，长期保存于-20。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。2. 蛋白酶抑制剂cooktail 所需母液成分： （1）100mmol/L PMSF PMSF 17.4mg 异丙醇 1ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20保存。 （2）10mM 亮肽素leupeptin: -20保存 （3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4保存 配制： 成分 终浓度 每ml裂解液所加母液量 PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍） 10ul Leupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍） 10ul Aprotinin 1ug/ml （储存浓度稀
3、释2000倍） 0.5ul 各成分直接加入所用的RIPA裂解液中 ，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg 95乙醇 50ml 85磷酸 100ml 蒸馏水至 1000ml 配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4保存于棕色瓶中。2牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4保存。上样用试剂14X上样缓冲液 1.0 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.
4、04g 甘油 4ml去离子水定容至10ml。混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。使用时稀释成1X。21.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20C。使用时稀释成1X。例如：上样量20l-4X上样缓冲液 5l+ DTT 2l + 样本蛋白13l工作液制胶用（1-6）：1. 1.0mol/L TrisHCl （pH6.8）Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L TrisHCl（p
5、H8.8）Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3. 10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4. 10过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g 蒸馏水 1ml （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4保存，保存时间为1周） 5 四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4C保存。6 30%丙稀酰胺： 4C保存。10%下层胶（两块胶，15ml）：依次加入
6、去离子水 5.9ml30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml10%SDS 150l10%AP 150lTEMED 6l每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加正丁醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加入 去离子水 4.1ml30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml10%SDS 60l10%AP 60l TEMED 6l每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入
7、TEMED混匀后应即刻灌胶。7 5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀） 9 10XTBS缓冲液 Tris（MW121.14） 24.2g NaC
8、l 80.0g 蒸馏水至 1000ml （浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。 101XTBST缓冲液10XTBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900mlTween-20 1 ml因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保存。11封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)： 1XTBST缓冲液 95-100 ml 脱脂奶粉 5g溶解后4保存，可于一周内使用。其他商品性试剂一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂操作步骤 （一） 蛋白样品制备 （1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、 倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，（暂不作可将培养皿
9、存于-80度）。 2、 向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min 3、 用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中，勺子在处理不同样本前清水洗净、擦干（注意冰上操作） 4、 超声处理（可选）注意蛋白悬液放于冰上，15sec处理，duty cycle 50-60 每次处理后清水洗探头、擦干，再作下一个 5、 于4下12000rpm离心5min。 6、 将离心后的上清分装转移倒1.5min的离心管中放于-80保存。 （2） 组织中总蛋白的提取： 1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（5ml离心管）。 2.匀浆器进行匀
10、浆，注意冰上操作，匀浆后置于冰上。 3.10，000g ,4,10min,（5ml管） 4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4,60min, 5.取上清至新1.5ml管,-80储存 （二） 蛋白含量的测定 1、 从-20取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。 2、 取7个5ml离心管，分别加入1mg/mlBSA:0、10、20、40、60、80、100ul，用蒸馏水补足各管至100ul。 3、样本取5ul，加蒸馏水95ul，使总量亦为100ul，混匀。 4、各管加G-250溶液2ml混匀，室温静止2分钟。 5、混匀后，在生物分光光度计上比色分析，测定595nm的光吸收，测定时浓度由
11、低到高。6、于Excel根据标准品绘制标准曲线，根据得出的公式计算样本浓度。 -（三） SDSPAGE电泳 （1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （2） 灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 （可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边） 2、 按前面方法配10下层胶（15ml，两块胶，每块胶在6.5 ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。 灌胶后胶上加一层正丁醇（1ml左右），液封后的胶凝的更快。 3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。弃去正丁醇，
12、用水冲洗，并用吸水纸将水吸干。 4、 等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量），目的蛋白GluT3一般在20-30l左右。取出上样样品至200l的EP管中，加入4上样缓冲液及DTT至终浓度均为1（上样总体积一般不超过30l）。上样前要将样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性（亦可以使用PCR仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了）。5、 按前面方法配5的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小（也提示胶已经凝固），从而使加样孔的上样体积减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1电泳缓冲液。6、加入1电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 *电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的上缘（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。7、上样 (注意：最外两泳道易跑歪，尽量不用。) Marker
