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1、绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆生物制药 2010级洪琰 3100703001 生物制药2010级林轩圣3100703005 生物制药2010级陈艳3100703006 生物制药 2010级李文敏3100703007 生物制药2010级王卉3100703047要:本实验主要研究绿色荧光蛋白（GFP）的在体外细菌的基因克隆，通过PCR扩增目的 基因，限制酶切割目的基因与载体，构建连接重组体，转入受体细胞 筛选重组体、 等步骤诱导绿色荧光蛋白在克隆菌中的克隆。关键词绿色荧光蛋白GFP基因表克隆1前言绿色萤光蛋白（green fluorescent protein），简称 GFP,是从水母（Aequ
2、orea victoria）体 内发现的发光蛋白。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第6567位氨基酸 （Ser-Tyr-Gly）形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧 光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞 后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。在蓝色波长范围的光线激发 下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷 光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互作用。2实验目的研究绿色荧光蛋白基因在DH5-克隆菌中的表达3实验原理3.1高纯质粒小量制备3.2获取外源基因（
3、PCR）3.3构建从组DNA （T连接）3.4从组DNA的转化3.5从组DNA的筛选（蓝白斑）3.6从组DNA的鉴定（酶切）4实验设备超净工作台； 恒温摇床； 咼压灭菌锅； 恒温培养箱； 台式高速离心机； 大容量冷冻离心机；PCR 仪；紫外分光光度计；水平电泳槽；垂直电泳槽；电泳仪；微波炉；凝胶成像系统；制冰机；超低温冰箱；微量加样枪（101, 1001, 10001）5实验材料5.1材料质粒：pEGFP-N1；T 载体：pUCm-T；菌种：DH5D（克隆菌）；PCR引物：FGGCATATGGTGAGCAAGGGCGARCGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56p5.2试剂：UC
4、m-T Vector （碧云天）；快速DNA连接试剂盒（碧云天）；两种限制性内切酶：EcoR I, Hind III （Fermentas）；质粒提取试剂盒（百泰克或BioEASY）；抗生素：氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）；X-gal、IPTG 等6实验操作步骤6.1高纯质粒的小量制备（材料中已经制备完毕）6.2获取外源基因（1 ） PCR反应体系设置取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂 （注意每换一种试剂换一个新吸头）：H2O6l质粒 DNA（pEGFP-N1）2l引物GFP1 （10M）1l引物GFP2 （10M）1lPremix Taq10l总
5、体积20l如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置离心机中瞬时离心，使反应液集中 于管底，然后将反应管放到基因扩增仪（PCR仪）上.PCR仪操作步骤操作PCR参数设置 94C预变性5分钟后开始以下循 环 94C 30秒56C 30 秒72 C 1分钟 72 C 7分钟 4 C保温30个循环，共计约1小时50分钟预热先不将PCR官插入模板，启动反应程 序启动反应程序待温度升至94C，按Pause键，暂停反 应程序，迅速将PCR管插入模板，盖 上盖子，再启动反应程序（2 ）琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物步骤操作1、凝胶准备 称1g琼脂糖置三角瓶中，加0.5 XTBE 100ml ； 微波
6、炉加热大约2分钟，熔 化琼脂糖；2、胶床准备将梳子垂直插入到胶床的小凹槽 内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；将胶床放在调整好的水平台 上;3、铺胶将冷却至60 C的凝胶加入5 110mg/ml溴化乙锭溶液（EB,剧毒）倒入 准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；4、室温下静置凝胶固化室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床 置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负 极；5、加入缓冲液向电泳槽中加入 0.5 X TBE电泳缓冲 液，越过凝胶表面即可；6、拔出梳子轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；7、样品准备样品准备：向核酸样品中加入约为样品 体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻 混匀；8、上样用加样器吸取样品，轻轻
7、的加入到凝胶 的样品孔中，加样量为6 pl ；9、开始电泳盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；10、电泳条件电泳条件：电压80120v，时间2030 分钟；11、电泳结束电泳结束后，切断电源，取出凝胶。12、结果分析电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电 泳条带13、观察结果，拍照取出凝胶，置于凝胶成像仪中拍照，观 察结果。6.3构建重组DNA (T连接)步骤操作连接体系设置将下列溶液依次加入一个无菌的Eppendorf管，充 分混匀T载体0.5|J l待插入片段1.5|J l快速连接缓冲液(2X)5.0pl双蒸水或MilliQ水2.5plRapid T4 DNA ligase0.5pl总体积10pl
8、连接反应16 C 反应 45min产物保存冷却后直接取5-10卩l用于转化6.4重组DNA的转化(1 )感受态细菌的制备(CaC12法)步骤操作1、细菌小量培养挑取 DH5 单菌落于2.5ml LB培养液中37C过夜培养2、扩大培养取其中500 l菌液于 含50mlLB培养液的锥形瓶中，37C 振摇培养至0D600值达到0.3-0.4之间3、实际细菌取50ml菌液置于离心管内，4 C 4500g离心5分钟4、CaCl2 处理加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴 30分钟4C 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞
9、，冰上放置几分钟，即成感受态细胞 悬液。5、感受态细胞的 收集和分装感受态细胞分装成100p l的小份，暂且不用的贮存于-70C可 保存半年。取其中一份进行转化(2 ) DNA转化步骤操作1、冰浴取制备好的感受态细胞100卩1,在冰浴中加入10p l酶连产物， 轻轻混匀，冰上静置30min；2、热击转化产物42C水浴中热击90s后，冰上放置2min；3、复苏加入8001LB液体培养基，37C, 100-180r/min荡培养45min4、涂板培养取1001悬浮细胞涂布在含氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)， X-gal、IPTG的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正 放30min后
10、，封口膜封好平皿，37C培养倒置12-16h6.5重组DNA的筛选(蓝白斑)步骤操作挑选从LB平板上挑选白色单菌落接种接种于4mlLB/Amp培养液中培养恒温摇床37 C振荡过夜培养6.6重组DNA的鉴定(酶切)(1 )提取质粒DNA步骤操作1、收集细胞将1.5ml培养液移至EP管中，9000r/min离心30s，弃上清液，将 管倒置于卫生纸，使液体流尽2、重悬浮细胞加入250l溶液P1，漩涡振荡使菌体沉淀重悬浮3、裂解加入250l溶液P2,温和地上下翻转EP管6-10次使菌体充分 裂解，直到溶液变得清纯4、复性加入400l溶液P3,立即温和地上下翻转EP管6-10次使混匀， 室温放置5min
11、5、离心13000r/min离心10min，小心取上清液6、上柱将吸附柱AC放于收集管中，向吸附柱AC中加入步骤(5)收 集的上清液，13000r/min离心1min，弃滤液7、漂洗加入500l去蛋白液PE， 13000r/min,离心1min,弃滤液，重复 该操作1次，然后空柱13000r/min离心2min,室温放置5min8、收集取出吸附柱AC放入一个新的EP管中，在吸附柱底部吸附膜的 中间部位加入70l缓冲液EB，室温放置1min，13000r/min离 心10min，洗脱DNA，收集洗脱液9、保存-20 C保存备用(2 )质粒DNA的酶切分析步骤操作1、酶切体系设在一个洁净的离心管中混匀下列反应物，充分混匀定H2O10 X M酶切缓冲液质粒DNAHind IIIEcoR I6 pl2 pl10 pl (5001001 pl1 pl0ng)总体积20“l2、酶切反应37 C水浴2h3、电泳鉴定向酶切产物中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀，进行电泳鉴定（用原提取的质粒DNA作对比）7结果及计算8注意事项9参考文献附录
