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1、叶绿体的提取和希尔反应活性检测摘要：通过差速离心法从油菜和青菜中提取叶绿体，并使用显微镜测微尺测量叶 绿体的大小。同时，利用收集到的叶绿体作为实验材料，对希尔反应活性进行检 测，结果表明：高温和药物制剂会使叶绿体失活或者活性大大降低，从而影响希 尔反应。关键词：；差速离心法；叶绿体；希尔反应前言：叶绿体是植物细胞中极为重要的一种细胞器，同时绿色植物通过叶绿体进 行光合作用制造氧气，供人类呼吸，对人类也是至关重要，因此对叶绿体进行一 系列的研究就显得很有必要。在提取叶绿体的时候采用研磨方法使细胞破碎得到 匀浆液，采用差速离心法分离到较纯的叶绿体，并用显微镜测微尺测量所得叶绿 体的大小。利用提取到
2、的叶绿体进行对希尔反应活性的检测，主要是向光照后的 叶绿体溶液中加入2,6-二氯靛酚(2, 6-DICP),用分光光度计检测其OD值，通 过观察单位时间内 OD 值的变化间接得出光合作用产物 H 的产量及叶绿体活性的 大小，从而总结出影响希尔反应活性的因素。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 生物材料油菜，青菜1.1.2 器材 小塑料盆，研钵，漏斗，纱布，离心管， 5ml 移液管，大橡皮头，试管，试管架 载玻片，盖玻片，比色杯，离心机，天平，水浴锅，分光光度计，光照培养室， 显微镜，显微镜测微尺1.1.3 试剂石英砂，冰块，提取介质：0.5mol/L 蔗糖、10mmol/L NaCl;10m
3、mol/L 2,6-DICP 溶液；2%Tri ton X-100.1.2 方法1.2.1 提取叶绿体(1) 在两个小塑料盆中装上冰块，其中一只装半盆冰块，从冰箱中取出一个冷 冻的研钵，将研钵放入这个小塑料盆的冰块中。另一只小塑料盆装满冰块，将离 心管插入其中预冷。(2) 称取青菜叶和油菜叶各5g，分别剪碎，分别放入两个研钵，加入10ml预 冷的提取介质和少许石英砂，在冰浴中迅速研磨成细浆，补加 5ml 提取介质。将 四层纱布铺在漏斗上再分别将淹没的细浆进行过滤，滤液收集到预冷的离心管中 各 10ml.(3) 室温下800rpm离心3min，离心后分别将上清液倒入另外预冷的离心管中。得到沉淀物
4、A1,A2。上清液在室温下2000rpm离心8min,弃上清液，沉淀物即为 叶绿体，并将沉淀物标记为 B1,B2。（4）在离心管中，分别用2ml介质悬浮沉淀物Al、A2，制成沉淀物悬液后，置 冰浴中备用。分别取一滴悬液，制成装片后用显微镜观察，并记录形态和颜色。（5）分别在离心管中用6ml介质悬浮沉淀物Bl、B2，得到叶绿体提取液，再分 别取一滴制成装片后置显微镜下观察，并记录叶绿体的形态、颜色和数量。（6）适当稀释叶绿体提取液，按1： 6稀释（用提取介质进行稀释），使叶绿体 稀释液的OD值在660nm 1.0左右。1.2.2 叶绿体希尔反应活性的测定（1）取试管架上的试管五支，分别编号各种物
5、质和进行预处理：1、 2、 3、 4、 5，然后按表格所示加入管号1提取介质 （ml）2.5叶绿体稀释液（ml）预处理2, 6-DICP （在 分光光度计室 加入）22.52.5 （青菜）1滴32.52.5 （青菜）沸水浴5min1滴42.52.5 （青菜）5 滴 2% Triton X-100 作用5min1滴52.52.5 （油菜）1滴（2）管作为分光光度计的调零管。当第2, 3, 4, 5管中加入2, 6-DICP后立即 摇匀（加入后立即测量），倒入做了标记的比色杯中，迅速测定620 nm处的OD 值，此即代表作用时间为0时的OD值。（3）然后将比色杯置于日光灯下照光，每隔3 min快速
6、读下OD值，连续进行光 照和读数，并将所测值记录到表格中。1.2.3 显微镜测微尺测量叶绿体的大小（1）正确使用显微镜测微尺测量叶绿体的大小（在40X下进行观察）（ 2）具体计算公式为台微尺的格数 目微尺每一小格的长度（um） = X10目微尺的格数 （3）为减少测量时的误差，一般测量 5 个以上叶绿体后计算平均值，并将结果 进行记录2.结果与分析2.1 所制悬液的观察结果（1）A1、A2 悬液在显微镜下为很多透明的不规则的碎片，还有部分较大块的绿 色物体。讨论可知透明碎片为石英砂，大块绿色物体为部分聚集在一起的叶绿体。（2）B1、B2 悬液在显微镜下，很多椭圆的绿色的物体为叶绿体，较小的运动
7、的 则为线粒体。讨论可知，叶绿体和线粒体在离体后依然具有活性。2.2 对叶绿体希尔反映活性的测定2 5 15 01十2号试管 亠3号试管 十4号试管 5号试管表一 各管 OD 值随光照时间的变化光照时间（分）管号、0369121521.2280.8870.6110.4150.3620.35831.5701.5641.5651.5651.5691.57041.2171.2941.3041.3161.3231.33351.2170.8340.5660.4070.4060.400叶绿体希尔反应活性测定中0D值随光照时间的变化图1叶绿体希尔反应活性测定中OD值随光照时间的变化1） 由上表可以计算出各管
8、 OD 值随光照时间变化的斜率，具体结果如下（由 于变化趋势用一整条折线表示不好计算斜率，因此分别取每条折线的第一 点与第三点作为标准点来进行斜率的计算）管号2号管3号管4号管5号管斜率0.1020.0010.0150.136（2）经过分析可得出结论：经过高温和药物处理的3 号管和 4 号管光密度值几 乎没有发生变化，即斜率都接近于0，说明高温和药物会影响叶绿体的活 性，从而降低甚至阻断希尔反映的发生。而比较 2 号管和 5 号管则可以发 现，在相同时间内，青菜中提取的叶绿体所制的悬液 OD 值随光照时间变 化的斜率小于油菜，即在单位时间内产生的 H 较少，因此青菜的光合作用 活性小于油菜。2
9、.3 所测叶绿体的大小表二 青菜叶绿体长度和宽度的测量结果在40倍物镜下，目镜测微尺的每格长度2.4 （um）叶绿体长度（目镜测微尺的格 数）宽度（目镜测微尺的格 数）长度（um）宽度（um）1224.84.82439.67.23224.84.84317.22.45327.24.8平均值（um）6.724.8表三 油菜叶绿体长度和宽度的测量结果在40倍物镜下，目镜测微尺的每格长度2.4（um）叶绿体长度（目镜测微尺的格 数）宽度（目镜测微尺的格 数）长度（um）宽度（um）1327.24.82429.67.23337.24.84214.82.45327.24.8平均值（um）7.24.81）
10、由以上两表可以看出，青菜和油菜的叶绿体大小相近，青菜叶绿体略比油 菜短，即从个体上来说，青菜叶绿体较油菜叶绿体小。3讨论3.1 所得结果基本与理论相符合3.2 与其他组同学的实验结果相比较，实验结果有别，但是总体趋势是一致的。3.3 通过实验得知，高温和药物制剂等因素会影响叶绿体的活性，从而影响希尔 反应。3.4 思考 青菜的光合作用活性小于油菜，可能就是因为青菜的叶绿体较油菜小，导致光合 作用时作用面积小于油菜叶绿体，所以希尔反应活性才会小于油菜。3.4 注意事项及关键步骤3.4.1 注意事项（1）在提取叶绿体时一定不能过于用力，否则将会损坏叶绿体，提取好的叶绿 体一定要置于冰浴的离心管中。（2）加入 2，6-DICP 时，要在分光光度计室内加，加入后应立即进行测定，在 整个过程中应该严格控制光照时间。（3）应熟练掌握显微镜测微尺的使用方法，在这样的基础上才能快速准确测量 出叶绿体的大小。3.4.2 关键步骤（1）叶绿体的提取（2）分光光度计的使用及对 OD 值的测量（3）显微镜测微尺的正确使用【参考文献】1张红锋编著。细胞生物学实验与探究。华东师范大学出版社
