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1、第四章植物病原菌分离与纯化二分离的准备分离的准备工作 无菌室操作前保持清洁无菌 接种工作准备培养基的准备分离材料选择不能与寄生表面直接通气影响消毒 效果，除气泡抽气、70%酒精浸2 一3秒A漂白粉常用表面消毒剂适用于病组织表面消 毒，也可处理种子成分：漂白粉10g,水140ml,过滤后使 用。最好现配现用，放久失效，有效成分CaCIO次氯酸钙好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯 气有强烈臭味。一般35min,时间长短因材料不同而 不同。处理种子5 10min,长的可达20 30minoA优点：杀菌能力强，具有挥发性，不 会遗留在组织上影响分离结果，其杀 菌能力小于升汞。(3)酒精：70%,浸很短
2、时间（几秒到1min）灭菌水洗。较大的材料在酒精中浸或棉花然后在火焰烧去。幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真 菌，消毒时间应尽量缩短。比较安全的方法是不用药剂消毒，而 以灭菌水换洗八九次。培养基的准备分离失败的原因，有时是由于培 养基不适宜。寄生性细菌对培养基的要求要比腐 生性细菌严格。一种适宜于纯培养的培养基不一定 适宜于分离（杂菌太多）有时分离失败的原因不是培养基 的成分不适宜，而是由于培养基 的酸度不适当或存放的时间太长。植物病原菌的分离培养基，可 以分为通用培养基和选择性 培养基。A通用培养基不加特殊抑制杂菌 生长的物质；选择性培养基一 般都要加制止杂菌生长的物
3、质。植物病原细菌分离时，要避免使 用选择性培养基，因为抑制杂菌 的物质一般并不杀死杂菌，而是 抑制杂菌的生长，因此，从分离 单个菌落繁殖得到的菌株仍可能 有杂菌。三、植物病原细菌的分离技术植物病原细菌一般用稀释分 离方法。A因为在病组织中病原细菌数量 巨大，分离材料中所带的杂菌 又大多是细菌，用稀释培养的 方法就可以使病原细菌与杂菌 分开，形成分散的菌落，从而 较容易获得植物病原细菌的纯 培养。植物病原细菌分离常用的消 毒方法A漂白粉溶液处理35min,然后 用无菌水冲洗A次氯酸钠溶液处理2min,然后用无菌水冲洗。分离培养基A肉汁腺培养基（NA）A马铃薯葡萄糖（或蔗糖）培养基pH调节至6.5
4、,稀释分离法制备细菌悬浮液 取灭菌培养皿加无菌水适量，切取 约4mm见方的小块病组织，经过表 面消毒和无菌水冲洗3次后，移在 无菌的研钵中将病组织研碎，静置 1015min，使组织中的细菌进入 水中置成悬浮液。配制不同稀释度的细菌悬浮液准备3-5个灭菌培养皿，每个皿加 200ul无菌水用灭菌移植环从第1个培养皿中移 植1-2环细菌悬浮液到第2个培养 皿中，充分混合后再从第2个培养 皿移植仁2环到第3个培养皿中， 依次类推，稀释的次数根据病组织 中细菌的数量而定。置带菌平板 将熔化的琼脂培养基冷却到45C 左右，分别倒入培养皿中，摇匀后 静置冷却，凝固后在培养皿盖上标 明分离材料、日期和稀释编号
5、等。挑取单菌落，转入斜面培养基。平板划线分离法制备细菌悬浮液划线（动画）用灭菌移植环蘸取以上悬浮液 在表面已干的琼脂平板上画线, 先在平板的一侧顺序画35条 线，再将培养皿转60。，将移植 环经火焰灼烧灭菌后，从第2条 线末端用相同方法再画35条 线。也有其他画线形式，如四分 画线和放射状画线等，其目的都 是使细菌分开形成分散的菌落。贴标签分离材料和日期等培养及结果观察挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。若分离成功，琼胶平板上菌落 形状和大小比较一致，即使出 现几种不同形状的菌落，终有 1种是主要的。如果菌落类型很多，且不分主 次，很可能未分离到病原细 菌，应
6、考虑重新分离。如果不熟悉1种细菌菌落的性 状，就应选择几种不同类型的 菌落，分别培养以后接种测定 其致病性，最终确定病原细 菌。一种细菌病害一般是由一种 病原细菌引起的，琼胶平板上 出现几种不同类型的菌落，实 质上只有一种是真正的病原 细菌。腐烂型的细菌病害即是混合侵染的，但也有一种是主要 的。各种植物病原细菌生长快慢 不同A假单胞菌属和欧文氏菌属细 菌：12天A土壤杆菌属细菌：23天A黄单胞菌属细菌：34天A棒杆菌属的细菌：58d才出现 明显的菌落。琼胶平板上菌落的观察主要 是：A形状和大小、颜色和光泽、表 面是否隆起或凹陷、边缘的形 状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等。在固体培养基上的菌
7、落形态A植物病原细菌菌苔形状的差异 一般是比较小的。菌苔的表面 有光滑的、不平整的和有皱褶 的、易挑取、质地均匀。A菌苔的颜色也不同，质地有粘 质的、膜质的或蜡质的。菌苔 有透明的、半透明或不透明的, 表面有暗色的或发鳧的。A菌落正反面或边缘与中央部位 颜色一致等特征。四、植物病原真菌的分病原真菌的种类繁多，其分 离的方法不同，而同一种材 料又可用不同的方法分离。 常用的分离法可以分为两大 类，即组织分离和稀释分离 法。稀释分离法适用于分离细菌和酵母，一般很少用于分离真菌，但大量产 抱的病原真菌和霉菌也用将抱子悬浮液与熔化并冷却到45 C的培养基混匀，倒平 板，但难于掌握温度，也可平 板涂布。
8、 组织分离法（真菌）切取小块病健交界处的病组 织，经表面消毒和灭菌水洗过 以后，移在琼胶培养基平板上 培养，待真菌长出后挑取菌丝 进行纯化，得到植物病原真菌 的分离方法。囊菌和半知菌等大多数真菌 用常规组织分离法分离组织分离法步骤环境的清洁和消毒分离用具的消毒分离材料的选择培养基平板制备病组织用水冲洗分离材料表面消毒分离材料接种将剪成23毫米大小组织用灭菌银子夹 取放入培养基平板上，轻轻按压。每皿 45块，排放均匀。贴标签和培养将培养皿翻转放置于23-25 C培养34 日纯化挑选由分离材料上长岀的典型而无杂 菌的菌落,在菌落边缘用移菌针挑取带 有菌丝的培养基一小块,转入试管斜面 培养基中央，于
9、25C温箱中培养。细菌的排除将培养基调节至酸性环境，10ml培养基中加3滴25%的乳酸加孟加拉红，配培养基时加入35mg/L除氯霉素外，其余均灭加抗生素, 菌后加入金霉素：抑制多数细菌(30ug/ml)青霉素:抑制G+细菌，20ug/ml 多粒霉素B：抑制G细菌(5ug/ml)链霉素：40ug/ml氯霉素：50ug/ml,大部分细菌真菌有菌丝可穿透培养基，而细菌 无这种能力，先将真菌接种倒平板 上，然后再加一层Agar,菌丝透过 而在表面生长加玻片，加玻棒，利用气生菌丝甩 掉细菌。病原真菌的分离举例斑点病病原真菌分离：取5x5 mm?组织一70%消毒几秒一 无菌水洗3次一升汞消毒3 5miri
10、f无菌水洗3次一接种 维管束内病原真菌分离：70% 酒精表面消毒一切去表面一/曲霉接种根腐病菌病原真菌分离：由材料大小决定：大f；小f肉质组织中病原真菌分离：采用种子内病原真菌分离：整粒种子表面消毒,水洗后f接 种到平板种子如在未裂开果荚中可不消 毒接种到平板抱子分离法配成抱子悬浮液以稀释法或划 线分离法/ 青霉(Pencillium)/ 链抱菌属(Alternaria)/ 小丛壳属(Glomerelia)/茎点菌属(Phoma)/ 拟茎点菌属(Phomopsis)特殊类型真菌的分离 采用特殊的方法分离特殊的培养基；如 集抱粘菌：(Acraciomycetes) 以E.coli为食专性寄主的用
11、诱饵分离采用特殊的培养条件温度 pH如立枯丝核菌的分离方法A诱饵法A离心法A快速生长法五. 影响病原菌分离失败的原因从以下几个方面寻找原因A材料：新鲜？病菌活否。杂菌 滋生状况A消毒剂及处理方法适宜否A培养基是否适宜，包括理化性 状A培养条件符合A菌的生物学特性，其对腐生条 件的适应能力六、病原菌的纯化技 术研究植物病原菌的遗传、变异性征，同异亲配合，都要求菌种单抱不同的病原菌纯化方法好坏 依人而异。平板稀释纯化法混菌法灭菌水冲洗f大致稀释（每皿30个菌 左右）一取一定量菌液悬浮液与熔化后 45C培养基混匀一合适温度培养一形 成菌落一移植平板涂布法取菌液0.1ml涤布一静5min或无菌 风吹干
12、一倒置培养应用范围细菌、酵母、产孑包多真菌纯化优点：操作简便缺点：不能看到和不能一个菌落是 从单抱繁殖而来，纯化可靠性差。应用范围：细菌.酵母.1产抱多真菌等细胞较大的植物病原菌纯化稀释纯化法将抱子（细胞）悬浮液中加适 量灭菌水f不断稀释再一小 滴悬浮液f镜检f只有一个 抱子的悬浮液f移植平板表面单泡分离法：取法 玻璃毛细管分离法单抱子分离法显微操作仪分离法七. 真菌的培养性状植物病害方面，培养真菌的目 的主要是观察它的性状和研 究环境条件对它的影响，或者 是大量繁殖后用于接种或其 他试验。培养的方法是将纯化的菌种， 根据试验的要求，移植在适当 的固体或液体培养基上培养, 后者可以静止或振荡培
13、养。A固体培养液体培养静一动培养性状的观察观察和记载的项目主要是：菌落的质地；菌落形成是凸起的或者有成簇的菌丝 体；形成成堆的抱子是干的或粘性的；各种子实体和休眠结构(厚垣抱子、菌 核等)的形成和所需的时间；菌落正面和背面的颜色,有无色素参入 培养基中；有无特殊气味；菌落中有没有部分呈扇状；生长率的快慢，如菌落长到一定直径所 需的时间。菌落的颜色也要不断地观 察，它的颜色是随着时间而改变的。培养性状的描述，要注明培养基的 种类、培养温度和有无光照等。真菌培养性状的观察，最好多用几种培 养基。/如镰刀霉属(Fusarium )和青霉属(Penicillium)等，在容种培养基上的 培养性状在鉴定
14、上是很重要的。八.植物病原菌的生长量测定植物病原微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体生 长很难测定，意义也不大。通常测定微生物的生长是测 群体的生长，测定繁殖则都要 建立在计数基础上。植物病原细菌生长量测定法直接法测体积粗放的方法，将待测培养液放在刻度离 心管中作自然沉降或进行一定时间的 离心，然后观察沉降物的体积。称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为 湿重的10%20%。离心法（细菌）/将待测培养液离心，再用清水洗涤离心 45次后干燥，可用105C 100C或 红外线烘干，或在较低的温度（80C 或40C）下进行真空干燥，然后称干 重。如细菌一个细胞一般重10-1210-13go过滤法/丝状真菌用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤 维膜等滤膜过滤。/过滤后，细胞可用少量水洗涤，再真空 干燥（40C以下）,称干重。间接法生理指标法A与生长量相平行的生理指标很多， 它们均可用作生长测定的相对值。测细胞总含氮量/大多数细菌的含氮量为干重的12.5%, 酵母菌为7.5%,霉菌为6.0%/含氮量的测
