一、立题依据1、现状分析及研究意义仔猪白痢病是农村养猪中的常发病、多发病常常由于延误医治时间，往往发生整窝死 亡，造成很大经济损失仔猪白痢病在临床上十分多见，它主要是由致病性大肠杆菌所引起 的以仔猪肠炎或败血症为主要症状的一种病症仔猪副伤寒是由猪伤寒沙门氏菌等引起的仔猪细菌性传染病沙门氏菌属是肠道杆菌科 的一个重要属，包括2 500种以上血清型，它们主要在人及动物的肠道内寄生，绝大多数 沙门氏菌对人和动物有致病性，能引起人和动物多种不同临床病变的沙门氏菌病，在医学和 公共卫生上均十分重要我小组主要基于以上的情况，针对疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪肝脏病样进行病原 菌的分离鉴定，以便通过实验来对两种重要病原菌的主要特征进行更深入的了解和掌握二、研究方案（一） 研究目的，研究内容和拟解决的问题1、 研究目的：本次设计性病原菌分离鉴定实验，意在提高我们的实践动手能力，让我们将所学的知识 综合运用，开拓自我思维，学会主动思考在病原菌的分离鉴定中，还可以促进我们对病原 菌生理特性的了解，以及对各种分离鉴定方法和技术的掌握以此提高我们对知识的综合运用 能力以及设计实验的谨慎思维能力2、 研究内容：将疑似疑似仔猪白痢与仔猪副伤寒病死猪肝脏病样进行初步观察并用取样进行实验室 病原菌的分离鉴定。
3、 拟解决的关键问题：① 确定并掌握病原菌的分离鉴定方法② 充分描述病原菌的特征，将它与已知的细菌特征对比，得出结论二） 、所需材料试剂、研究方法及预期结果1、所需材料试剂1.1材料：病死猪肝脏病样1.2试剂：氯化镁孔雀绿增菌培养基、麦康凯琼脂培养基、SS营养琼脂培养基、微量生化发 酵管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡磷胨、尿素、枸橼酸盐、甘露醇、h2s），美兰， 结晶紫，碘液，酒精，品红，三糖铁培养基、厌氧肉汤和普通肉汤附:普通肉汤：牛肉膏0.15g+蛋白胨0.3g+Nacl0.l5g+H20 30mL混合倒入容器搅拌均匀（牛 肉膏和蛋白胨均用玻璃纸称量后一起放入容器加热后取出，Nacl用标准纸）一称总重一加 热融化（搅拌至煮沸）一补水（10g=10mL）—加NaoH调PH （7.4-7.6）,用试纸检验一过滤 一分装3管一包装好进行灭菌厌氧肉汤：之前步骤与普通肉汤相同，在普通肉汤的基础上没管加入肝粒5~6块，每管加石 蜡密封，包装好灭菌2、研究方法2.1指出所给病样及组织2.2初步观察病样2.3.细茵分离病例需进行实验室检查，可从实质器官中取少量病样，依次进行直接染色镜检 观察，增菌培养同时鉴别培养，菌落特征观察，麦康凯平板扩大培养，染色镜检，接种肉汤 和厌氧肉汤，生化鉴定。
2.3.1直接染色镜检无菌取肝脏病料涂片，美兰染色镜检观察细菌在组织中的形态特点，并进行描述绘图2.3.2增菌培养同时鉴别培养无菌取肝脏病料接种到氯化镁孔雀绿（MM）增菌营养汤中，于37°C增菌培养24h无菌用接种环从病样组织中勾取少量组织划线接种于麦康凯平板，置37C培养24h2.3.3菌落特征的观察（若菌落生长情况不好，则需将增菌汤中取样重新划线麦康凯平板， 培养后再进行菌落的观察）接种麦康凯平板并置37C培养24h后，观察其上生长的菌落的形态特征并描述2.3.4扩大培养挑取单个麦康凯平板上的典型菌落（大肠杆菌为淡黄色菌落，沙门氏菌为粉红色菌落）接种 于新的麦康凯平板，置37C培养24h，进行纯化扩大培养2.3.5.染色镜检勾取麦康凯琼脂培养基上单个菌落涂于载玻片上，固定后，革兰氏染色（制片一一火焰固定 ——结晶紫（1~2 '） ——冲洗——G氏碘液（1~3 '） ——冲洗—— 5%的酒精（30 ”一1 '） ——碳酸复红（10 ” ~30 ”）——冲洗滴油,镜检2.3.6接种肉汤和厌氧肉汤无菌勾取麦康凯琼脂培养基上平板单个菌落分别进行肉汤和厌氧肉汤的接种，并置37C培 养24h后观察描述。
2.3.7生化鉴定挑取麦康凯琼脂培养基上单个菌落接种微量生化管作生化鉴定2.3.7.1糖发酵实验:对含葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖的生化管进行穿刺接种，培养2~3 天后进行观察凡培养基变为黄色及产生气泡则表示该菌发酵此糖产酸产气凡培养基不变 色的，表示该菌不发酵此糖2.3.7.2 MR试验:接种葡萄糖蛋白胨水培养管，经2~3天培养取出后的葡萄糖蛋白胨水 培养管，加入MR试剂2~5滴，结果呈现红色为阳性，否则为阴性2.3.7.3 VP试验：接种葡萄糖蛋白胨水培养管，经2~3天培养取出后的葡萄糖蛋白胨水 培养管，先加入VP试剂甲3ml，再加入VP试剂乙lml,摇匀后静置试管架上1~2小时，观 察结果，变红为阳性，变黄为阴性，变橙色为介于中间2.3.7.4甘露醇发酵实验：接种培养后观察接种后管内颜色是否变黄，若变黄则发酵甘露 醇观察有无气体产生2.3.7.5枸橼酸盐利用试验:观察经2~3天培养的枸橼酸盐琼脂管是否有细菌生长，并观察 其颜色变化凡有细菌生长，培养基变为天蓝色者，为该细菌利用枸橼酸盐否则为阴性反 应2.3.7.6硫化氢试验:观察经2~3培养的醋酸铅琼脂管，是否有气泡出现2.3.7.7尿素酶测定:观察经2~3天培养的尿素琼脂管，是否有颜色变化。
2.3.7.8三糖铁试验：勾取细菌划线于三糖铁斜面并穿刺到内部观察三糖铁斜面和内部 颜色变化及是否有气柱变黄则产酸，变黑则产h2s3、预期结果：3.1所给病样为死猪肝脏3.2可见肝有干酪样坏死，肝点状出血，肝稍肿大，边缘钝圆3.3.1若为只有沙门氏菌感染3.3.1.1无菌取肝脏病料涂片，美兰染色镜检结果：若只有蓝色中等大小的杆菌较明显，则初步判断有沙门氏菌3.3.1.2鉴别培养后的菌落观察：麦康凯平板上长出淡黄色透明、光滑圆整的细小菌落在SS琼脂平板生长出灰色、中心带 黑色的菌落，为沙门氏菌的特有性状3.3.1.3染色镜检结果：勾取经扩增纯化后的麦康凯琼脂平板上无色菌落经革兰氏染色涂片镜检为革兰氏阴性（G -），中等大小的杆菌3.3.1.4接种肉汤和厌氧肉汤：普通肉汤和厌氧肉肝汤均呈混浊，下部有沉淀3.3.1.5生化试验：3.3.1.5.1糖发酵试验：对含葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖的生化管进行穿刺接种，培养后 观察到被检菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、且产酸产气，不能发酵乳糖、蔗糖3.3.1.5.2 MR试验：取培养后的管，加入MR试剂2~5滴，结果呈现红色，为阳性3.3.1.5.3VP试验：培养后先加入VP试剂甲3ml，再加入VP试剂乙1ml，摇匀后静置试管 架上1~2小时后变黄色。
为阴性3.3.1.5.4甘露醇发酵试验：培养后管内颜色变为黄色，有气体产生，说明该菌发酵甘露 醇产酸产气3.3.1.5.5枸橼酸盐利用试验：经2~3天培养后有细菌生长，培养基变无变化，说明该细 菌不能利用枸橼酸盐3.3.1.5.6硫化氢试验：观察经2~3培养后的醋酸铅琼脂管，结果为有气泡出现为阳性3.3.1.5.7尿素酶测定：观察经2~3天培养的尿素琼脂管，无颜色变化为阴性3.3.1.5.8三糖铁试验：勾取细菌划线于三糖铁斜面并穿刺到内部培养后在三糖铁琼脂 上的反应为三糖铁琼脂的底面变黄，底部有气柱，说明产气，斜面颜色变黑，即产生硫化氢3.3.2若为只有大肠杆菌感染3.3.2.1无菌取肝脏病料涂片，美兰染色镜检结果：若蓝色两端钝圆的短杆菌较明显，则初步判断有大肠杆菌3.3.2.2鉴别培养后的菌落观察：在麦康凯琼脂平板上形成中等大小，表面光滑湿润的粉红色菌落勾取单个菌落接种于伊红 美蓝琼脂平板，则形成紫黑色具有金属光泽的小菌落，为大肠杆菌的特有性状3.3.2.3染色镜检结果：勾取经扩增纯化后的麦康凯琼脂平板上的粉红色菌落，经革兰氏染色涂片镜检为革兰氏阴性 菌（G-）、形态为两端钝圆的短杆菌，多数散在排列。
3.3.2.4接种肉汤和厌氧肉汤：普通肉汤和厌氧肉肝汤均呈混浊，下部有沉淀3.3.2.5生化试验：3.3.2.5.1糖发酵实验，对含葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖的生化管进行穿刺接种，观察到 被检菌能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖，且产酸产气，不能发酵蔗糖3.3.2.5.2 MR试验：取培养后的管，加入MR试剂2~5滴，结果呈现红色为阳性，为阳性3.3.2.5.3 VP试验：培养后先加入VP试剂甲3ml，再加入VP试剂乙lml,摇匀后静置试管 架上广2小时后无颜色变化3.3.2.5.4甘露醇发酵试验：培养后管内颜色变为黄色，有气体产生，说明该菌发酵甘露醇 产酸产气3.3.2.5.5枸橼酸盐利用试验：经2~3天培养后有细菌生长，培养基无变化，说明该细菌不 能利用枸橼酸盐，为阴性3.3.2.5.6硫化氢试验，观察经2~3培养后的醋酸铅琼脂管，结果为无气泡出现为阴性3.3.2.5.7尿素酶测定，观察经2~3天培养的尿素琼脂管，无颜色变化为阴性3.3.2.5.8三糖铁试验：勾取细菌划线于三糖铁斜面并穿刺到内部在三糖铁琼脂上的反应 为三糖铁琼脂的斜面和底面都变黄，底部有气柱，说明产气，斜面颜色没有变黑，即不产生 硫化氢。
3.3.3若为沙门氏菌与大肠杆菌混合感染3.3.3.1无菌取肝脏病料涂片，美兰染色镜检结果：为蓝色中等大小的杆菌混有蓝色两端钝圆的短杆菌，则初步判断有沙门氏菌和大肠杆菌3.3.3.2鉴别培养后的菌落观察：麦康凯平板上长出淡黄色色透明、光滑圆整的细小菌落同时有中等大小，表面光滑湿润的 粉红色菌落，可以基本判断沙门氏菌混合大肠杆菌若不形成明显的菌落，则需将增菌汤 中取样重新划线麦康凯平板，培养后再进行菌落的观察，以及纯化培养3.3.3.3染色镜检结果：勾取经扩增纯化后的麦康凯琼脂平板上菌落（大肠杆菌麦康凯平板和沙门氏菌的麦康凯平 板）经革兰氏染色涂片镜检大肠杆菌经革兰氏染色涂片镜检为革兰氏阴性菌（G-）、形态 为两端钝圆的短杆菌，多数散在排列勾取经扩增纯化后的麦康凯琼脂平板上无色菌落经革 兰氏染色涂片镜检为革兰氏阴性（G-），中等大小的杆菌3.3.3.4接种肉汤和厌氧肉汤：普通肉汤和厌氧肉肝汤均呈混浊，下部有沉淀3.3.3.5生化试验：3.3.3.5.1沙门氏菌生化试验：3.3.3.5.1.1糖发酵试验：对含葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖的生化管进行穿刺接种，培养 后观察到被检菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、且产酸产气，不能发酵乳糖、蔗糖。
3.3.3.5.1.2 MR试验：取培养后的管，加入MR试剂2~5滴，结果呈现红色，为阳性3.3.3.5.1.3 VP试验：培养后先加入VP试剂甲3ml，再加入VP试剂乙1ml，摇匀后静置 试管架上1~2小时后变黄色3.3.3.5.1.4甘露醇发酵试验：培养后管内颜色变为黄色，有气体产生，说明该菌发酵甘 露醇产酸产气3.3.3.5.1.5枸橼酸盐利用试验：经2~3天培养后有细菌生长，培养基变无变化，说明该 细菌不能利用枸橼酸盐3.3.3.5.1.6硫化氢试验：观察经2~3培养后的醋酸铅琼脂管，结果为有气泡出现为阳 性3.3.3.5.1.7尿素酶测定：观察经2~3天培养的尿素琼脂管，无颜色变化为阴性3.3.3.5.1.8三糖铁试验：勾取细菌划线于三糖铁斜面并穿刺到内部培养后在三糖铁琼 脂上的反应为三糖铁琼脂的底面变黄，底部有气柱，说明产气，斜面颜色变黑，即产生硫化 氢3.3.3.5.2大肠杆菌生化试验：3.3.3.5.2.1糖发酵实验，对含葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖的生化管进行穿刺接种，观察 到被检菌能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖，且产酸产气，不能发酵蔗糖。