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1、1.HPLC法测定大鼠血浆中的山奈酚1. 1.1目的要求掌握血浆样品的前处理方法。2. 熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。3. 熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评价内容。1.2主要实验材料与仪器山奈酚(Kaempfero1)及其对照品，黄苓素(baicalein)，抗坏血酸，肝素邛-葡萄糖醛酸苷酶(P-glucuronidase)和硫酸酯酶(sulfatase)，分析纯甲醇，冰醋酸、无水乙醚，色谱纯乙腊；高效液相色谱仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，13000r/min台式离心机，不同规格移液枪(5,20,50,100,200,1000pL)和容量瓶(10，25mL)，51
2、0mL具塞离心管若干；雄性SD大鼠(180220g)。山奈酚黄苓素1.3实验原理山奈酚吸收进入体内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的形式存在。由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得，故采用加入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品，使代谢物水解后测定苷元山奈酚的浓度。实验以黄苓素为内标，HPLC法测定血浆中山奈酚浓度，对建立的方法进行方法学评价。1.4实验方法1. 色谱条件：C18柱（250mmx4.6mm,5pm）,配保护柱，柱温40C；乙腊-0.5%冰醋酸（35:65）为流动相，流速1mL/min；检测波长370nm；进样量20pL。2. 溶液配制：取山奈酚对照品约2.5mg，精密称
3、定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密吸取适量，分别用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20和30pg/mL的标准系列溶液，置4C冰箱保存。另取黄苓素适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释至0.1mg/mL的溶液，精密吸取1.5mL置10mL量瓶中，用甲醇定容，得内标溶液，置4C冰箱保存。3. 血浆样品处理：取大鼠血浆样品120pL，加入甲醇20pL、1%冰醋酸（含2mg/mL抗坏血酸）32pL、。-葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL）和硫酸酯酶（6U/mL）的混合水溶液50pL，37C水浴温育30min后，加入内标溶液50pL，然后加无水乙醚2mL，漩涡混合5min，于12000r/min
4、离心5min；取上清液在氮气流下挥干，残留物用100pL甲醇复溶，12000r/min离心5min，取上清液进样分析。4. 专属性考察：取空白血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、血浆样品，按“血浆样处理”项下方法处理，照“色谱条件”项下方法进样测定。比较所得色谱图，考察血浆内源性物质是否干扰测定，药物及内标是否达到基线分离。若有必要，适当调整色谱条件，已达到专属性要求。标准曲线制备：精密吸取120pL大鼠空白血浆9份，分别加入20pL不同浓度的标准系列溶液，制得0.0（空白）、0.0（空白+内标）、0.05、0.1、0.5、1.5、3和5g/mL的山奈酚血浆标准溶液（每个浓度点平行35份）。按“
5、血浆样品处理”项下自“加1%冰醋酸32叫”起，同法处理后进样分析，记录峰面积。以山奈酚与内标峰面积的比值（R）对山奈酚血浆浓度（C）进行线性回归（两个空白不计入回归曲线，仅作为对干扰的考察），求得回归方程（R=bC+a）和相关系数（r）。并取各浓度点实测值代入回归方程得回归值（仗）,与标示值（C）比较，计算偏差（偏差%=1x100%）和准确度（准确度=CC，/Cx100%）。根据上述结果确定线性范围与定量下限（LLOQ）。5. 回收率和精密度试验：精密吸取120叫大鼠空白血浆，分别加入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制低、中、高（0.1、1、却g/mL）三种浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行5份，
6、按“标准曲线制备”项下方法进行处理、测定。将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线，求出测得浓度。计算测得浓度与加入浓度的比值，得方法回收率，并计算各浓度点的相对标准差（RSD），作为日间精密度；于不同日（至少3d）重复上述测定，计算日间精密度。6. 萃取回收率试验：精密吸取120L大鼠空白血浆，分别加入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制0.1，1和4g/mL浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行5份，按“标准曲线制备”项下方法进行处理，记录山奈酚峰和内标峰面积，作为萃取后的测定值。另取上述低、中、高同样浓度的山奈酚甲醇液，加同样量内标溶液，混合，直接于氮气流下挥干，残留物用100pL甲醇复溶，12000
7、r/min离心5min，取同样量上清液进样分析，获得山奈酚峰和内标峰面积，作为未萃取的测定值。采用外标法计算萃取后山奈酚峰面积与相应浓度的未经萃取的山奈酚峰面积比值，得山奈酚萃取回收率；同法计算内标的萃取回收率。7. 稳定性实验：精密吸取120叫大鼠空白血浆，按“回收率和精密度试验”项下方法配低、中、高浓度的山奈酚血浆样品。考察其在室温下放置24h（6,12,24h取样）、-20C下长期冻存1个月（10,20,30d取样）、反复冻融（-20C室温）3次的稳定性，将测得结果与0时的结果进行比较，计算RSD。并考察测定溶液的稳定性，即样品制备后到进样分析的放置时间（6,12,24,36,48h）的
8、稳定性。8. 血浆样品测定：将山奈酚按1mg/kg的剂量尾静脉给予禁食12h的SD大鼠，于给药前（0min）和给药后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240min分别从眼眶采0.4mL血，8000r/min离心5min，分离血浆。按“血浆处理方法”项下方法处理后，在HPLC上进样分析，记录峰面积。将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线，计算血浆中山奈酚的浓度，绘制药-时曲线。1.5注意事项1. 山奈酚和内标多为多羟基化合物，对光、热不稳定，测定时应注意避光操作。2. 大鼠眼眶采血容易控制采血的时间周期，采血质量高，而且不受是否尾静脉注射给药的影响，故这种采血方法相对优于尾静
9、脉注射。当线性范围较宽时，宜采用加权最小二乘法进行回归计算，以使低浓度结果较正确。LLOQ偏离标准浓度应M20%，其他各点偏离标准浓度应M15%,rM0.09.山奈酚和内标的萃取回收率应接近，差异不超过10%。1.6参考文献田杨,蒋学华，杨平，等.HPLC测定大鼠血浆中山奈酚.华西药学杂志,2008,23(3):357.1. 2HPLC-MS/MS法测定人尿中左氧氟沙星浓度2.1目的要求掌握尿样测定的前处理方法。2. 掌握LC-MS测定中基质效应和专属性的考察方法。3. 熟悉LC-MS分析中质谱条件的选择。2.2主要实验材料与仪器盐酸左氧氟沙星胶囊(0.1g或0.2g)，左氧氟沙星(levof
10、loxacin)和环丙沙星(ciprofloxacin)对照品，色谱纯甲醇、甲酸，分析纯醋酸铵；液相色谱-质谱联用仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，不同规格移液枪(5，20，50，100，200，10001)和容量瓶(10，25mL)，10m1具塞离心管若干。2.3实验原理以环丙沙星为内标，建立尿中左氧氟沙星的LC-MS/MS测定方法，着重考察方法的专属性和基质效应，选择最佳色-质条件。质谱测定方法采用多反应离子监测(MRM)方式。2.4实验方法1.色谱和质谱条件：色谱柱为C18柱(100mmx2.1mm,3.5pm)；甲醇-Immol/L醋酸铵溶液-甲酸(35：65：0.01)为流动相，流
11、速0.25mL/min；进样量10pL。电喷雾(ESI)离子源，正离子电离模式，多反应离子监测(MRM)的MS扫描方式，左氧氟沙星和内标环丙沙星的检测离子对划分别为362.2一318.2和332.2一288.20(m/z)；MS参数：毛细管电压5.5kV，加热温度400C。2. 标准溶液配制：取约5mg左氧氟沙星对照品，精密称定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，精密吸取适量，用甲醇分别稀释成5、10、25、50、100、150、250和500pg/mL的标准系列溶液，置4C冰箱保存。取5mg环丙沙星，精密称定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。取适量用甲醇稀释成200pg/mL，即得内标
12、溶液，置4C冰箱保存。尿样处理：取1mL人尿液样品，加入10pL内标溶液，再加入2mL水（根据实测浓度调整稀释倍数，同时考察调整后的基质效应），混匀，用0.45pm孔径的偏氟膜过滤，取10L滤液进样分析。3. 专属性考察：取人空白尿样、添加左氧氟沙星和内标的空白尿样、健康受试者口服盐酸左氧氟沙星胶囊后的尿样（加内标），按“尿样处理”项下自“再加入2mL水”起，依法处理后，在选定的条件下进样分析，比较三者图谱，考察方法专属性。必要时对色谱、质谱条件作适当调整。4. 基质效应的评价：取人空白尿液1.0mL，加入2.0mL水，混匀，用0.45pm孔径的偏氟膜过滤得滤液。在滤液中分别加入不同浓度的左氧
13、氟沙星标准溶液，使其终浓度分别为0.5，1.5和4pg/mL每浓度点平行3份。另用纯水代替空白尿液，同法操作。将上述溶液分别进样测定，获得相应的峰面积。以同浓度下两种不同处理方法的样品峰面积（A尿A水）的比值来评价基质效应。5. 标准曲线制备：精密量取不同浓度的标准系列溶液10pL，置氮气流下挥干，精密加入人空白尿液1.0mL，漩涡混合，制成浓度分别为0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5、2.5和5pg/mL的氧氟沙星尿液标准溶液，每浓度点平行2份。按“尿样处理”项下方法处理后，进样分析，记录峰面积。以左氧氟沙星与内标峰面积的比值对左氧氟沙星尿样浓度进行线性回归，得回归方程。尿液样品
14、的测定：健康男性志愿者单剂量口服0.10.2g盐酸左氧氟沙星胶囊，在服药前和服药后不同时间段收集尿液，记录体积。按“尿样处理”项下方法处理后，进样分析，记录峰面积。将左氧氟沙星与内标的峰面积比值代入标准曲线，计算尿药浓度。2.5注意事项1. 尿液主要成分是水、尿素、盐类，易长细菌，宜4C冷藏或加防腐剂。2. 左氧氟沙星主要以原型自肾排泄，在体内代谢甚少。口服48h内尿中排出量约为给药量的80%90%。尿中浓度随给药量变化而变化，尿中达峰时间约为2h，可先进行预试，根据尿中实际浓度，调整尿液稀释倍数。3. 不同型号的LC-MS仪、色谱柱，测定条件可能有较大差异，需要进行优化。2.6参考文献施爱明
15、，潘杰，张全英，等.LC-MS/MS法测定人血浆中左氧氟沙星浓度.药学进展，2008,32(5):228.3GC-MS法测定大鼠肝脏组织中盐酸克伦特罗浓度1. 3.1目的要求掌握固相萃取法的原理和方法。2. 熟悉组织样品的前处理方法。3. 熟悉GC-MS质谱条件的选择。3.2主要实验器材与仪器盐酸克伦特罗(clenbuterolhydrochloride)样品和对照品，分析纯双甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA),甲醇、甲苯、乙酸乙酯、盐酸、氢氧化钠、碳酸钠等。GC-MS联用仪、涡旋混合器、恒温干燥箱、高速冷冻离心机、组织匀浆机、阳离子交换萃取小柱SD大鼠（180220g）。盐酸克3.3实验原理利
16、用盐酸克伦特罗的碱性，采用碳酸钠碱性条件下使盐酸克伦特罗游离，用有机溶剂乙酸乙酯萃取。然后在有机相中加入稀盐酸酸化，使克伦特罗离子化而溶于酸水中，进一步采用阳离子交换固相小柱去除杂质。再与BSTFA衍生化，用GC-MS进行检测。3.4实验方法1.色谱和质谱条件：GC色谱柱为HP-5MS毛细管柱（30mx0.25mmx0.25pm）；程序升温：初始柱温70C（保持1min），以20Cmin升至180C（保持1min），以5Cmin升至220C（保持2min），以25Cmin升至260C（保持2min）；进样口温度280C；不分流进样，进样量1.0pL；载气高纯He：1.0mDmin。EI源，源温度200C；传输线温度280C；电离电压为70eV；四级杆温度160C；测定方式为全扫描和选择离子检测，条件如下：03.5
