实验四细菌的接种培养法与生长现象的观察【目的和要求】1. 掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点2•掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法3.熟悉细菌生长现象的观察方法试剂与器材】1 •菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等2•培养基：固体、半固体、液体培养基3.其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等实验内容】一、细菌的接种工具1. 接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）其中 环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用, 但因为价格昂贵而限制了其应用目前实验室常用的是经济实用的300〜500W电热镍鉻丝 一般要求接种环长5〜8cm，直径为2〜4mm,定量接种环的容量为0.001ml2——Stran荊対22cm安装环徉十刚蝎口磴）图4-1接种环和接种针接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另 一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分 朝内压紧接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。
2. L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成在使用之前用厚纸包扎后置 高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌主要用于液体标本涂布接种二、细菌的接种方法1液体培养基的接种该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应方法：（图4-2）（1） 先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌2） 左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧 灼灭菌3） 将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中4） 将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处5） 在试管上做好标记，经35°C培养18〜24h后观察结果2. 半固体培养基的接种该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应方法：（图4-3）（1） 先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落2） 左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，试管口通过火焰灭菌，将接种针 从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约5mm处（勿穿至管底），然后由原穿刺 线退出，（3） 将试管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处4） 在试管上做好标记，经35°C培养18〜24h后观察结果。
3. 平板划线接种法该法可将标本中的多种细菌分散成单个菌落，有利于细菌的分纯和进一步鉴定 方法：（1）连续划线法（图4-4）1） 先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落2） 左手斜持平板，用手掌托着平板底部，五指固定平板边缘，在酒精灯旁以拇指、食 指和中指将平板盖撑开大约30~45°角，将已挑取细菌的接种环先在平板一侧边缘均匀涂布, 然后运用腕力将接种环在平板上自上而下，来回划线划线要密，但不能重叠，充分利用平 板的面积，不能划破琼脂表面，并注意无菌操作，避免空气中的细菌污染3） 划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处4） 在平板底上做好标记，经35C培养18~24h后观察结果图4-4固体培养基连续划线法（2）分区划线法（图4-5）1） 先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落2） 同上法将平板盖打开约30~45°角，将已挑取细菌的接种环在平板一端（1区）内作 来回划线，再在2、3、4区依次划线，每区的划线须有数条线与上区交叉接触，每划完一区 是否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定，每区线间需保持一定距离，线条要密而不重 复3） 划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。
4） 在平板底上做好标记，经35C培养18~24h后观察结果图4-5固体培养基分区划线法4.斜面培养基接种法（图4-6）斜面培养基主要用于细菌的纯培养，以进一步鉴定细菌或保存菌种1） 将接种环（或接种针）在火焰上烧灼灭菌，待冷却后以无菌操作挑取少许菌落2） 左手拿试管，打开试管塞后，试管口通过火焰灭菌，再将取有细菌的接种环由斜 面底部向上划一直线，再由下至上在斜面上作曲线划线3） 试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处4） 在试管上做好标记，经35°C培养18〜24h后观察结果5 •涂布接种法本法主要用于活菌计数和药敏试验1） 活菌计数：取一定稀释度的菌液0.1ml滴在平板上，用无菌L型玻璃棒将液滴涂 布均匀，盖上平板盖，经35C培养18~24h后计数菌落，则每毫升所含活菌数=菌落数x10x 稀释倍数2） 直接涂布法：多用于纸片法和管碟法药敏试验先配制一定浓度的菌液，用无菌 棉签蘸取菌液后，在管壁上将多余的液体挤去，在MH琼脂平板上按三个方向均匀涂布3 次，最后沿平板边缘涂一周盖上平板盖，置室温放置5min使平板表面稍干，然后用无菌 镊子将药敏纸片贴在培养基表面，或向竖在平板表面的牛津小杯内加入不同浓度的药物，经 35C培养18~24h后观察结果，测定抑菌圈直径，按判断标准判定结果。
6 •倾注培养法此法常用于标本或样品中活菌计数1）方法：1） 将标本用无菌生理盐水稀释成不同浓度:10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等2） 取不同稀释度的标本各1ml分别注入直径90mm无菌平皿，迅速加入溶化并冷却至 约50C的营养琼脂15m 1,轻轻转动平板使之充分混匀，待凝固后翻转平板3） 置35C温箱孵育18~24h，计数菌落形成单位（colony forming unit， CFU）,按下式 算出每ml标本中的细菌数：1ml标本中的活菌数=全平板CFUX稀释倍数7 •细菌接种的注意事项（1） 细菌接种过程中需注意无菌操作，避免污染，因此每一步操作均需严格按要求进 行操作时不宜说话或将口鼻靠近培养基表面，以免呼吸道排出的细菌污染培养基2） 所有操作均需在酒精灯火焰附近进行，平皿盖、试管塞、瓶塞均应拿在手上打开 （具体见前述），禁止将盖或塞事先取下放置在桌面上3）取菌种前灼烧接种针（环）时要将镍鉻丝烧红，烧红的接种针（环）稍事冷却再取菌种，以免烧死菌种4） 取菌时注意菌落不要取得太多，应蘸取而不宜刮取，否则平板划线很难分离出单 个菌落5） 平板划线时注意掌握好划线的力度和角度，用力不能过重，接种环和培养基表面 大约呈30〜40。
角，划线要密而不重复，充分利用培养基，并注意不能划破平板半固体培 养基接种时注意穿刺线要直，并沿原穿刺线退出6）接种完毕后，需在培养基上做好标记再放置温箱孵育废弃的有菌材料（如玻片、 有菌的平板、试管、吸管等）均需灭菌后再清洗发生有菌材料污染应及时进行消毒处理三、细菌的培养方法1.需氧培养法该法适用于需氧菌和兼性厌氧菌将接种后的培养基（试管放试管架上，平板底上盖下） 置35°C培养箱，培养18-24h大多数细菌生长速度快，在孵育18〜24h后即可见到生长现象， 但若标本中的菌量少或生长速度慢的细菌（如结核分支杆菌），则需培养3~7天甚至4~8周 后才能观察到生长现象2. CO2培养法（1） CO2孵育箱：能自动调节箱内CO2的浓度和温度，使用方便2） 烛缸法：取一有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨口处上涂上凡士林将接 种后的培养基放入缸中，并在缸内放一支点燃的蜡烛，加盖密封随着缸内蜡烛燃烧产生的 CO2增加，蜡烛逐渐自行熄灭，此时缸内的CO2浓度约为5〜10%,置35C培养箱孵育18~24h 后观察结果见图4-7）]|一禺凡士林图4-7烛缸法d（3）化学法（重碳酸钠-盐酸法）：按每升容积重碳酸钠0.4g与1mol/L盐酸0.35ml比 例，分别将二种试剂置于容器内，将容器放置在标本缸中，密封后倾斜容器，使二种试剂接 触混合产生CO2。
该法适用于奈瑟菌和布鲁菌等苛养菌的培养3•微需氧培养：先用真空泵将容器内的空气排尽，再注入5%02、10%CO2、85%N2的 混合气体，然后置于35C培养箱孵育后观察结果该法适用于空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等 微需氧菌的分离培养4•厌氧培养法：（1）厌氧罐培养法：用理化方法使容器内形成无氧环境，用于专性厌氧菌培养常用 的方法有抽气换气法和气体发生袋法1） 抽气换气法：将已接种的培养基放入真空干燥缸或厌氧罐中，再放入催化剂钯粒和 指示剂美蓝先用真空泵将缸内抽成负压99.99kPa （750mmHg）,再充入无氧氮气，反复三 次，最后充入80%N2、10%H2和10%CO2混合气体，若缸内呈无氧状态，则指示剂美蓝为 无色每次观察标本后需重新抽气换气，用过的钯粒经160C2h干烤后可重复使用2） 气体发生袋法（Gas-pak法）：该法需以下二种容器：厌氧罐一一是由透明聚碳酸酯 或不锈钢制成，盖内有金属网状容器,其内装有厌氧指示剂美蓝和用铝箔包裹的催化剂钯粒； 气体发生袋一一是一种铝箔袋，其内装有硼氢化钠-氯化钻合剂、碳酸氢钠-柠檬酸合剂各1丸和1张滤纸条，使用时剪去特定部位，注入10ml水，水沿滤纸渗入到二种试剂中，发生 下列化学反应，产生h2和CO2。
立即将气体发生袋放入罐内，密封罐盖，使气体释放到罐 中C6H8O7+3NaHCO3^Na3（C6H5O7）+3H2O+3CO2 f NaBH4+2H2Of NaBO2+4H2 f（2）厌氧袋法：厌氧袋是用无毒透明、不透气的复合塑料薄膜制成袋中装有催化剂 钯粒和2支安瓿，分别装有H2、CO2发生器（化学药品，成分同上）、指示剂美蓝使用时 将接种细菌的平板放入袋中，密封袋口，先将袋中装有化学药品的安瓿折断，几分钟后再折 断装有美蓝的安瓿，若美蓝为无色则表示袋内已处于无氧状态，置35°C温箱孵育3）需氧菌共生法：将已知专性需氧菌（如枯草芽胞杆菌）和待检厌氧菌分别接种到 2个大小相同的平板上，将两者合拢，缝隙用透明胶密封，置35C温箱培养，需氧菌生长过 程中消耗氧气，待氧气耗尽后，厌氧菌即开始生长4） 平皿焦性没食子酸法:按每100ml容积加入焦性没食子酸1g和2.5mol/LNaOH 10ml （也可用Na2CO3）的比例，先将焦性没食子酸放入平皿盖背面的灭菌纱布中,再滴入NaOH，立即将接种细菌的平板扣上，用熔化的石蜡密封平皿和平皿盖的缝隙，置35 C温箱培养5） 庖肉培养基法:将庖肉培养基上面的石蜡熔化，用毛细管吸取标本后接种于培养 基中，待石蜡凝固后置37C孵育。
用于培养基中的肉渣可吸收氧气，石蜡凝固后起隔绝空 气的作用，从而使培养基内呈无氧状态6） 厌氧手套箱培养法:厌氧手套箱是目前国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一 它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在 箱内进行操作箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着使用时将物品放入箱 内，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气、换气（h2, co2, n2）使之达到厌氧状 态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门箱内保持厌氧状态， 是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中残余氧化合成水的原理该箱可调节温度，本身是孵 箱或将孵箱附在其内该法适于作厌氧菌的大量培养研究四、细菌生长现象的观察1．液体培养基中的生长现象: 浑浊生长（如葡萄球菌）、沉淀生长（如链球菌）、菌膜生长（如枯草杆菌） 观察要点:注意观察培养基的透明度、管底和液面上是否有细菌生长2．半固体培养基中。