IgG刺激诱发的小胶质细胞Toll样受体4表达及细胞因子分泌

IgG刺激诱发的小胶质细胞Toll样受体4表达及细胞因子分泌 作者：吴瑞, 刘玲, 彭正午, 段小莉, 王百忍, 靳亚平, 邝芳【摘要】 　　目的: 了解在体外培养条件下免疫球蛋白G (IgG) 刺激对小胶质细胞表达Toll 样受体4（TLR4）和分泌细胞因子的作用方法: 用不同浓度的IgG (2 mg/L、 20 mg/L、 200 mg/L)及脂多糖（LPS）（10 mg/L）刺激原代培养的大鼠小胶质细胞, 24 h后以免疫荧光染色观察TLR4的表达, ELISA法检测培养上清中肿瘤坏死因子α（TNFα）和γ干扰素（IFNγ）的含量结果: IgG直接作用于体外培养的小胶质细胞后, 以剂量依赖的方式引起TLR4的表达和TNFα的分泌, 但未检测到IFNγ含量的变化作为阳性对照的LPS引起了小胶质细胞TLR4表达, 并诱导了TNFα及少量IFNγ的分泌结论: 同种IgG刺激可使体外培养的小胶质细胞大量表达TLR4, 可能通过MyD88依赖途径导致炎性细胞因子分泌结果提示至少在中枢神经系统的固有免疫反应中, TLR4可能发挥识别病原体之外的蛋白分子, 例如IgG的作用 【关键词】 小胶质细胞; 免疫球蛋白G; Toll样受体4; 肿瘤坏死因子α; γ干扰素　　［Abstract］AIM: To investigate the effects of immunoglobulin G（IgG） on the expression of tolllike receptor 4 (TLR4) and secretion of cytokines in microglial cells in vitro. METHODS: Cultured primary rat microglial cells were stimulated with different concentrations of rat IgG (2 mg/L, 20 mg/L, 200 mg/L) and lipopolysaccharide (LPS) 10 mg/L for 24 h, respectively. The TLR4 expression in the microglial cells was examined by immunofluorescence staining and tumor necrosis factorα (TNFα) and interferonγ (IFNγ) levels in the culture medium were assayed by ELISA. RESULTS: IgG stimulation induced a significant TLR4 expression and TNFα secretion in cultured microglial cells in a dosedependent manner, while IFNγ was not detected in the same medium samples. As a positive control, LPS caused increases of TLR4 expression and both IFNγ and TNFα production in the microglial cells. CONCLUSION: TLR4 expression could be induced in microglia in vitro by nonpathogenic protein, IgG from the same species. Therefore, congeneric IgG stimulation might lead to proinflammmatory cytokine production, probably via MyD88dependent pathway. This finding suggests that TLR4 may play more roles than pathogen recognition of innate immune reactivity, at least in the central nervous system.　　［Keywords］Microglia; Immunoglobulin G; Tolllike receptor 4; Tumor necrosis factorα; Interferonγ　　固有免疫（innate immunity）是生物体在进化过程中获得的具有普遍性的防御机制, 是宿主对抗病原侵袭的第一道防线, 在获得性免疫（adaptive immunity）系统被活化前发挥抗感染作用［1］。

Toll 样受体4（TLR4）是革兰氏阴性细菌胞壁产物脂多糖（LPS）的特异性识别受体, 对病原体识别有重要作用［2］中枢神经系统（central nervous system, CNS）因被血脑屏障（Bloodbrain barrier, BBB）保护、 缺乏淋巴系统及没有免疫细胞而被认为是“免疫特免区”, 但脑内很多疾患的发生发展中均伴有免疫反应研究发现, TLR4 mRNA 广泛表达在中枢神经系统, 如脑膜, 脉络丛和室周器官［3］, TLRs也表达于小胶质细胞, 如人的小胶质细胞也表达TLR4［4］, 在中枢神经系统的细菌或病毒的识别和免疫应答的产生过程中起关键作用［5］ 　　肥大细胞、 T细胞和IgG在某些生理或病理条件下可以通过BBB渗入脑内［6］我们以前的研究发现, 静脉注射肾上腺素引起的动物一过性高血压可使BBB开放, 血液循环中的内源性IgG可因此进入脑内, 并被小胶质细胞吞噬［7］据报道, TLR4在CNS主要表达在小胶质细胞上而不是寡突胶质细胞或者神经元［8］; 而且体外培养的小胶质细胞在LPS作用下可以被激活而释放IL1β、 TNFα 以及其他多种炎性分子［9］。

那么非特异性IgG在进入CNS后是否会引起炎症反应、 是否通过小胶质细胞表面模式识别受体TLRs活化而产生固有免疫应答目前仍不清楚为此, 我们在体外培养条件下观察了IgG刺激后小胶质细胞TLR4的表达以及细胞因子的分泌情况, 以探讨TLR4是否参与IgG引起的小胶质细胞的反应机制　　1 材料和方法　　1.1 材料　　新生1 d SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供LPS（E.coli 0127: B8）购自美国Sigma公司纯化的大鼠 IgG购自北京中山公司小鼠抗大鼠TLR4购自英国Abcam公司, 兔抗大鼠Iba1购自日本Wako公司, Alexa 488 结合的驴抗小鼠IgG和Alexa 594结合的驴抗小鼠IgG购自美国Molecular Probes公司大鼠TNFα和IFNγ ELISA 试剂盒购自晶美生物公司　　1.2 方法　　1.2.1 小胶质细胞的分离培养　　新生1 d 鼠10只, 无菌条件下剪开颅骨, 取出脑组织, 分离皮层至含DHank’s液的培养皿中反复冲洗以去除血污, 在解剖显微镜下轻轻剥去脑膜和血管, 用DHank’s液洗1～2次剪碎组织块至1～2 mm, 加入体积比组织块总量多30～50倍的0.125 g/L 胰酶, 37℃下消化25 min, 加入含100 mL/L胎牛血清的完全DMEM培养液终止消化7～8 min, 吸出组织至另一含100 mL/L胎牛血清的完全DMEM培养液的离心管, 吹打制成单细胞悬液, 静置, 收集上清液, 接种于细胞培养瓶中, 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱, 培养10～12 d。

取出, 将培养瓶放在260 r/min的摇床上振摇1 h, 收集上清, 离心, 沉淀细胞, 再以完全DMEM重悬细胞, 接种于24孔板（孔中铺有多聚赖氨酸包被好的玻片）, 37℃ 50 mL/L CO2培养箱培养　　1.2.2 细胞处理　　将接种于24孔板的小胶质细胞于37℃、 50 mL/L CO2培养箱继续培养2～3 d, 加入IgG（终浓度分别为2 mg/L、 20 mg/L、 200 mg/L）, LPS（终浓度10 mg/L）作为阳性对照IgG和LPS均以不含血清的DMEM配成, 并以同样的不含血清的DMEM做空白对照作用24 h后收集上清液, 同时取细胞爬片做免疫荧光染色　　1.2.3 免疫荧光染色　　以 40 g/L多聚甲醛固定细胞爬片, 室温, 20 min, 0.01 mol/L PBS洗3次, 每次5 min以10 g/L 的小牛血清白蛋白（BSA）封闭, 室温, 30 min0.01 mol/L PBS洗5 min×3抗大鼠TLR4抗体（1∶100）和抗大鼠Iba1抗体（1∶800）混合后孵育, 室温过夜0.01 mol/L PBS洗5 min×3, Alexa 594结合的驴抗大鼠IgG (1∶800)和Alexa 488 结合的驴抗大鼠IgG（1∶400）混合孵育, 室温避光3 h, 用以结合上述抗大鼠抗体, 再用Hoechest 33258 室温衬染细胞核20 min。

以上两步骤间均用0.01 mol/L PBS充分漂洗3次, 每次10 min, 然后用50%甘油PBS溶液封片, 于Olympus FV1000共聚焦显微镜下观察结果　　1.2.4 双抗夹心ELISA法测细胞培养上清中TNFα和IFNγ水平　　收集上清液, 按照试剂盒说明检测TNFα和IFNγ水平, 呈色后以酶标仪450 nm测定吸光度, 数据经换算成浓度（x±s）后以SPSS软件进行单因素方差分析, P<0.05时差异有统计学意义　　2 结果　　2.1 小胶质细胞的纯化　　经免疫荧光染色鉴定, 收集到的小胶质细胞纯度>90%（小胶质细胞标志物Iba1的免疫荧光染色, 图1 A）　　2.2 TLR4免疫荧光染色　　同种IgG直接作用于体外培养的小胶质细胞24 h后, 细胞中可见可大量表达的TLR4免疫阳性产物(图1D、 E、 F箭头所示黄色标记), 分布于胞膜和胞浆而且随着IgG浓度增加, 表达TLR4的小胶质细胞数量有增加的趋势, 其形态也发生改变, 胞体增大, 并向外伸出一些伪足, 呈煎鸡蛋型LPS阳性对照组的小胶质细胞也表达TLR4(图1C箭头所示), 但细胞形态改变不大, 与空白对照组(图1B)的细胞相似。

　　2.2 细胞因子含量变化　　在LPS阳性对照组的胶质细胞的培养上清中检测到有微量的IFNγ分泌（数据未显示）, 而在不同浓度IgG刺激的各组小胶质细胞培养上清中均未能检测到IFNγIgG刺激小胶质细胞分泌TNFα与空白对照组相比显著升高（P<0.05）: IgG 2 mg/L组为(146.67±26.5) ng/L, IgG 20 mg/L组为(291.33±10.7) ng/L, IgG 200 mg/L组为(386.33±56.77) ng/LLPS组为（580.7±22.01）ng/L, 空白组为（230.3±24.9）ng/L（图2）与空白对照组相比, IgG 20 mg/L、 200 mg/L刺激组明显增高, 差异极显著（P<0.01）, 且TNFα分泌量与IgG的浓度有剂量依赖倾向（图2）　　3 讨论 TLR4炎症信号通路的激活不仅导致轻微的炎症反应, 而且刺激机体产生并释放大量细胞因子抵抗感染［10］脑室内注射LPS, 标志神经胶质细胞激活的一些分子如MHCⅡ、 TLR2和TLR4 的表达则增加［11］本研究在体外培养的小胶质细胞中加。