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1、抗原蛋白纯化流程实施细节1 将 anti-MYC 单克隆抗体偶联在溴化氢活化的琼脂糖凝胶柱上。 （CNBr-activated Sepharose 4B Amersham）1 透析：使用 NaHCO3 pH=8.3 溶液对 anti-MYC 抗体进行透析，4 度透析过夜。 通过 BCA 法测定抗体浓度。2 称取琼脂糖柱冻干粉（ 1g 冻干粉对应 3.5ml 体积）。根据琼脂糖凝胶柱：纯化的 anti-MYC 4C5抗体=1ml : 810mg的比例称取相应质量的琼脂糖冻干粉。使用 1mM HCl 重悬。再用水冲洗后用 NaHCO3 pH=8.3 溶液平衡柱料。 3将激活的琼脂糖凝胶柱和抗体按照
2、上述 2 步骤中偶联比例于4 度混合过夜，进行 偶联。4漂洗：将偶联柱料填充到层析柱内，使用 5 倍柱料体积的偶联液漂洗。 5使用 0.1MpH=8.0 Tris-HCl 终止偶联反应。6漂洗：使用5倍柱料体积的0.1M醋酸（pH=4.0） 0.5M NaCl和0.1M Tris-HCl （pH=8.0）0.5M NaCl 交替进行漂洗各 3 次。7柱料保存在 TBS（pH=7.0） +叠氮钠中。2 柱平衡1 使用移液器，将 0.5ml 柱料添加入层析柱中。2 使用 5 倍柱料体积的 TBST 冲洗一次。3 使用 1 倍柱料体积的 pH=3.5 甘氨酸冲洗三次。此步骤时间控制在 20 分钟内。
3、4 使用 10 倍柱料体积的 TBST 冲洗三次。5 使用 10 倍柱料体积的裂解缓冲液冲洗 2 次。3 使用 500ul 裂解缓冲液重悬柱料。4.把细胞裂解液中加入0.5ml柱料，在4度混合2h,进行抗原抗体结合。5 将结合后的柱料添加到层析柱中。6. 使用 3ml 细胞裂解液冲洗柱料。7. 加入 10 倍体积的 TBST 冲洗三次。8. 加入 1ml TBS 重悬柱料。9. 加入甘氨酸预洗脱蛋白。10. 准备两只 1.5ml EP 管，加入 100 ul 甘油。11. 使用1ml甘氨酸进行洗脱，洗脱液收集在上述10步骤中的EP管中。 共洗脱两次，每次使用 1ml 甘氨酸进行洗脱。12. 使用NaH2PO4 （pH=11）进行中和。12. 使用 BCA 法测定蛋白浓度。13. 使用SDS-PAGE估算蛋白纯度以及主带蛋白浓度。
