《绿色荧光蛋白基因的克隆与表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《绿色荧光蛋白基因的克隆与表达（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分子生物学综合实验论文题 目：绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达中国黄石2010 年 12 月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803 班 湖北 黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物 体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28a经过 BamH I和Not I双酶切连接后，得到pET-28a-pEGFP-N3重组质粒。取部分的重 组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌 E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。重组有GFP基因的E. coLi
2、BL-21,在含有1吐/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。当A6oo达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙 基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即 可。关键词： 绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆 荧光蛋白 水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight, College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abs
3、tract：Green fluorescent protein( GFP) ,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28a was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After tr
4、eating the two targeted plasmids with BamH I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28a-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(BamH I and Not I).The recombinant pla
5、smid lefting would be transported to E. coLi BL-21 the competent cells. E. coLi BL-21 containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 yL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL 卩-D-thiogalactopyranoside was added to
6、0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words: Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1. 前言：GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP)2. 实验试剂及实验仪器： 52.1 实验试剂与材料： 62.2 实验仪器： 73. 实验方法 73.1 质粒提取方法: 73.2 琼脂糖凝胶电泳及回收: 93.3 酶切及连接： 113.4E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入： 123
7、.5 酶切验证重组质粒： 133.6GFP 基因的表达 143.6.1 活化菌种143.6.2 扩大培养143.6.3 iPTG 诱导 GFP 基因的表达 144. 结果与分析 144.1 质粒提取过程中现象与结果： 144.2 琼脂糖凝胶电泳 154.3E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入结果：164.4 酶切验证重组质粒 164.5 GFP基因的表达结果： 175. 讨论： 185.1 提取质粒出现图六的原因是： 185.2 琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： 185.3 E. coLi DH5a或E. coLi BL21感受态制备及转入出现图九、十原因：.1
8、95.4 酶切验证重组质粒出现图十一原因： 195.5 GFP基因的表达结果如图十二、十三原因： 196. 参考文献 20前言：1.1 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)1.1.1 GFP 研究背景 绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生 物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。日本科学家 下村修 1962年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白, 如图一所示。这种蛋白在紫外线光中呈现绿色, 这种水母 体内含有一种生物发光蛋白质 aequori n，但它本身发蓝光，通过对光谱 的研究, 下村修提出了发光景水母所发的绿
9、 光是因激发的水母素向绿色荧光蛋白图一：夜晚水母体内GFP显色Figurel Chromogenic GFP inFellyfish at night4发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体 ， 而绿 色荧光蛋白成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的 应用， 但水母素是荧光酶的一种 ， 它需要有荧光素底物 ， 经过 酶促反应后发光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我 们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、 紫外光下呈现强烈绿色2。1987年，道格拉斯普莱沙(Douglas Prasher)克隆出了 GFP的基因序列。1993年，在普莱沙的基础上
10、，马丁沙尔菲(Martin Chalfie)成功地通过基因重 组的方法使得除水母以外的其他生物(如大肠杆菌等)也能产生GFP，这不仅证 实了 GFP与活体生物的相容性，还建立了利用GFP研究基因表达的基本方法， 而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿 色革命”揭开了序幕。此后，谢尔盖路基亚诺夫(Sergey A. Lukyanov)又从一种珊瑚中分离出了 与绿荧光蛋白类似，但能发出红色光的荧光蛋白，预示着荧光蛋白可以有不同的 颜色。美籍华人钱永健(Roger Y Tsien)系统地研究了绿荧光蛋白的工作原理,。 钱永健还对绿色荧光蛋白进行了颜色突变。不同颜色可以
11、同时在同一个细胞或组 织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色荧光蛋白的出现， 为研究蛋白之间的相互作用、蛋白分解等提供了无限的可能性。现在世界各地实验室使用的 GFP , 都是经过改造优化了的, 而钱永健是这方面的先驱和领先人物2。1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，如 图二 长420 nm,宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行卩折叠组成，荧 光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底 部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色 团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身
12、环化和氧化形成2。HSVTK poly Afl oriCMV IEpUC ori4selSnaB IB4DStu(2575)Dra III(1870)ApaL(4358)AflW (1636)co01091(3852)MCS(591-665)SV40 poly ApEGFP-N34.7 kbBsrQ I (1385)A/of I (1398) Xba I*(1408)SV40ori pSV40 j e图二：GFP晶体结构Figure2 Crystal structure of GFP图三: 质粒 pEGFP-N35Figure3 pEGFP-N352001年1月11日，美国科学家宣布培育成世界
13、上首只转基因猴, 这是世界 上首次培育成功转基因灵长类动物. 添加在这只名为安迪的猴子体内的就是这 种标志基因。1.1.2 GFP 研究应用在生物学研究中，科学家们更多的是利用这种能自己发光的荧光分子来作为 生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不 可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞 或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。但传统的荧光标记在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导至被观察 的细胞死亡，这叫做光毒性”因此，在GFP发现以前，科学家们只能通过荧 光标记来研究死亡细胞静态结构。相反，绿色荧光蛋白对生物体无毒无害,分子
14、 量小,方便构建载体,同时在多种非水母的生物体中均可稳定表达并易于检测 , 所以，作为一种生物分子标记，具有广泛的应用前景3由于GFP荧光是生物细 胞的自主功能,是一种现成的荧光蛋白质，荧光的产生不需要任何外源反应底物, 因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无 法比拟的。本实验是利用实验室提供的质粒PEGFP-N3,其结构如图三所示.其上有 所用酶的酶切位点。1.2基因的克隆与表达基因克隆（分子克隆 molecularcloning）-通-过体外重组技术，将一段目的 DNA 经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的 过程。如下图四所示:
15、所需元件:限制性内切酶:BamH I和Not I（BamH I的切点为： 5，GJGACC -3Not I 的切点为 5JGCJGGCCGC -33CCTAGJG -53CGCCGGjCG -5载体：E. coLiDH5a （1易于接纳外源DNA o 2.无特异的内源性核酸内切酶3. 载体复制、扩增不受阻 4.与质粒有互补性）受体细胞：E. coLBL-21 （1易于接纳外源DNA。2.无特异的内源性核酸内切酶3. 载体复制、扩增不受阻 4.与载体有互补性）目的基因: pEGFP-N3选择标记基因：pET-28 a （同时含有抗kana的基因有助于后面选择，和&半乳糖 苷酶基因可被异丙基硫代-伕D-半乳糖苷（IPTG ）诱导表达目的基因GFP ） 连接：平末端连接（相同酶切产生互补的粘性末端，再通过碱基互补配对连接）原核基因表达系统(Gene Expression)：由于目前对原核生物基因结构了解的要透彻一些，所以一般将目的基因导入到原 核生物中。将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效 地表达、合成基因产物的体系
