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1、hTERTmRNA在胃癌中表达及其与预后的效果观察4700字 胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，就诊患者中约90%为进展期胃癌，极易发生侵袭、转移，预后差，严重威胁着人们的身体健康。探讨胃癌侵袭转移的分子机制，寻找与其相关的生物学标志物是当今肿瘤学研究的热点之一1。端粒酶是一种与细胞永生化和肿瘤形成相关的核糖核蛋白酶，它能够以细胞内部的一段RNA为模板合成端粒末端重复序列而延长端粒，从而使细胞永生化。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是人类端粒酶的催化亚单位，是端粒酶活性高低的限速酶。hTERT的表达与端粒酶活性呈正
2、相关，可以反映端粒酶活性的高低2-4。研究已证实，端粒、hTERT与正常细胞生长调控及恶性肿瘤之间密切相关。目前有关hTERT在胃癌中的研究多集中在胃癌发生的始动阶段，hTERT高表达可促进胃癌的发生5。然而，hTERT与胃癌侵袭、转移及预后的关系研究相对较少。本研究选取52例胃癌患者为研究对象，应用RT-PCR方法检测hTERT mRNA在同一患者的正常胃黏膜、胃癌原发灶及转移灶（即转移淋巴结）中的表达，通过随访，系统研究hTERT mRNA在胃癌中的表达情况及其与胃癌恶性生物学行为和预后的关系。1 资料与方法1.1 一般资料以2001年9月2002年9月中国医科大学附属第一医院肿瘤外科52
3、例胃癌患者为研究对象，收集患者新鲜大体组织标本。在手术切除胃癌大体标本30 min内，切取胃原发癌灶和正常胃黏膜及转移淋巴结，放入消毒灭菌的EP管中，于液氮中速冻0.5 h后转入-70冰箱中冻存等待检测，以上标本均经病理证实，并保留其石蜡标本。对52例患者进行随访，主要通过门诊复查、电话信函问询、派出所户籍查询等，随访终点为2010年9月，随访率为100%，随访时间为8106个月，平均48.5个月。 1.2 RT-PCR检测hTERT mRNA的表达严格按照TRIzol试剂盒说明书进行操作，提取所有新鲜大体标本总RNA，测定其OD260、OD280值，对总RNA进行定量；应用RNA琼脂糖凝胶电
4、泳检测其完整性。取高质量总RNA 1 μg进行逆转录合成第一链cDNA，然后取3 μl cDNA水溶液进行PCR扩增，具体条件：94 5 min，94 40 s、58 45 s、72 60 s（30个循环），72 7 min。hTERT基因引物序列为：5′-CGTCCAGACTCCGCTTCAT-3′，5′-TGCTTCTTGTGGTCCTCAGA-3′，产物为340 bp；内参基因GAPDH引物序列为：5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′，5′-CGACCACTTTGTCAAGCT
5、CA-3′，产物为227 bp。扩增产物经梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色检测，详细步骤参见文献6。用Fluorchem V2.0 Stand Alone电泳凝胶扫描仪对电泳凝胶进行扫描，应用其自带的分析软件进行灰度（A）测定，电泳中有扩增产物条带者为阳性，无扩增产物条带者为阴性；计算hTERT mRNA表达指数（ImRNA），I=A（hTERT）/A（GAPDH），ImRNA与其在组织中的表达量呈正比。1.3 统计学方法应用SPSS 19.0统计软件分析数据，应用配对均数t检验比较hTERT mRNA在胃原发癌灶、正常胃黏膜、淋巴结转移癌中表达的差异；应用单因素方差分析评估其在胃原发
6、癌中表达与胃癌生物学行为的相关性；应用Kaplan Meier分析绘制生存曲线，采用Log Rank检验评估其在胃原发癌灶中表达与预后的关系，以P20 cm2、淋巴结分期（7th TNM分期）晚者（N3）者中表达水平明显增高，而在限局型癌、肿瘤未浸透浆膜面、浆膜侵犯面积≤20 cm2、淋巴结分期早者（N12）中表达水平相对较低。其表达水平与其他临床病理因素无明显相关性（如肿瘤大小、部位、分化程度、生长方式、有无脉管癌栓，患者性别、年龄等）（表1）。2.3 hTERT基因 mRNA表达与胃癌患者预后的相关性将hTERT mRNA在胃原发癌灶中表达水平以平均值为界分为高低两组（其表达指数平均值为0.515），高于平均值者为高表达，低于平均值者为低表达，两组各26例。分析两组胃癌患者的生存情况，并绘制生存曲线（图2）。经Log Rank检验发现，hTERT mRNA低表达组比高表达组预后明显好（χ2=14.20，P=0.0002）；hTERT mRNA低表达组患者5年生存率为60.04%，高表达组患者为17.41%，两组差异有统计学意义（P
