眉题 3恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究刘春琴1 余养盛1 白 钢1* 杨文博1 陈 宁2 怀立华2(1. 南开大学生命科学学院 天津 300071)(2. 天津科技大学生物工程学院 天津 300222)摘 要: 对以DL-2-氨基-∆2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-∆2-thiazoline-4-carboxylic acid, DL-ATC)为底物原料, 经微生物酶法催化合成L-半胱氨酸, 并进一步氧化和分离纯化产物L-胱氨酸的生产工艺和条件进行了研究建立了以恶臭假单胞菌TS1138 (Pseudomonas putida TS1138)全细胞为酶源, 反复多次催化底物合成L-半胱氨酸, 并以2.0%二甲基亚砜(DMSO)为氧化剂氧化生成L-胱氨酸, 进而通过001×7型阳离子交换树脂纯化胱氨酸的新工艺采用高效液相色谱法考察该方法L-胱氨酸的总收率可以达到78.55%, 纯度为99.12%该方法简单高效, 解决了酶稳定性差不能重复使用, 而固定化酶方法繁琐成本高的问题, 为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径关键词: 恶臭假单胞菌, DL-ATC, L-半胱氨酸, L-胱氨酸, 生产工艺Study on L-cystine Conversion Technology by Pseudomonasputida TS1138LIU Chun-Qin1 YU Yang-Sheng1 BAI Gang1* YANG Wen-Bo1CHEN Ning2 HUAI Li-Hua2(1. College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071)(2. Bioengineering College, TianJin University of Science and Technology, Tianjin 300222)Abstract: A technology of L-cystine production was studied in this paper, which included microbial enzymatic conversion of DL-2-amino-∆2-thiazoline-4-carboxylic acid (DL-ATC) to L-cysteine, subsequent oxidization of L-cysteine to L-cystine and its purification. The cells of Pseudomonas putida TS1138 could be repetitively used as the enzyme sources to convert the substrate DL-ATC to L-cysteine. After being oxidated by 2% dimethy-sulforide (DMSO), L-cystine could be harvested and further purified by the positive ion-exchange resin 001×7. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) identified the purified L-cystine as having a total recovery of 78.55% and purity of 99.12%. This study demonstrated an efficient and convenient method for L-cystine production, which overcame the instability of enzymes, troublesome procedures and high cost of enzyme immobilization as contrasted to the traditional method. All in all, it provides a new approach for industrial production of L-cystine as well as L-cysteine.Keywords: Pseudomonas putida, DL-ATC, L-cysteine, L-cystine, Production process 恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究 49L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸, 广泛应用于医药、食品、化妆品以及饲料工业[1]。
目前, 工业上主要通过毛发酸水解生产L-半胱氨酸该工艺生产率低, 且产生大量刺激性气体和废酸造成环境污染[2]另外, 由毛发水解法或其它方法获得的含半胱氨酸反应液, 由于其组成复杂[3], 并且半胱氨酸在水中的溶解度较高[4], 所以要从复杂的反应液中分离出高纯度的半胱氨酸是困难的但半胱氨酸易被氧化成胱氨酸, 而胱氨酸在水中的溶解度极低[4], 通常利用这一特性可将反应液中的半胱氨酸首先转化成胱氨酸, 沉淀析出, 然后再将分离出的胱氨酸电解还原成半胱氨酸[5], 从而可获得半胱氨酸纯品自Sano[1,6]等发现嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌(Pseudomonas thiozolinophilum)能够把DL-2-氨基- ∆2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-Amino-∆2-thiazoline-4-carboxylic Acid, DL-ATC)转化为L-半胱氨酸, 利用微生物酶法生产半胱氨酸已成为人们研究和关注的方向[7]本实验室自行分离获得一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TS1138, 并发现其具有转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的能力[8]本研究对TS1138菌株转化生成的半胱氨酸后的氧化条件、分离纯化、产物鉴定以及酶源细胞的重复利用等方面进行了初步研究, 为微生物酶法制取L-胱氨酸和L-半胱氨酸的生产工艺奠定了基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种: 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) TS1138, 本实验室筛选获得[8]1.1.2 培养基[9]: 种子培养基: 葡萄糖20 g, ATC 3 g, 玉米浆5 g, 尿素3 g, NaCl 1.5 g, MnSO4·H2O 0.1 g, K2HPO4 3 g, MgSO4· 7H2O 0.5 g, FeSO4·7H2O 0.01 g, 定容至1 L, pH 7.5; 产酶培养基: 葡萄糖30 g, ATC 4 g, 玉米浆1 g, 尿素3 g, NaCl 1.5 g, MnSO4·H2O 0.1 g, K2HPO4 3 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, FeSO4·7H2O 0.01 g, 定容至1 L, pH 7.51.1.3 主要试剂和仪器: L-半胱氨酸和L-胱氨酸标准品为美国Amresco公司产品; DL-ATC购自天津试剂二厂; 高效液相所用试剂为色谱纯, 其他试剂为国产分析纯发酵使用上海保兴的BIOTECH- 10BGZ型发酵罐; DL-ATC和L-胱氨酸的含量检测采用岛津LC-10AT高效液相色谱仪和Model 200S ELSD 蒸发激光散射检测器; 旋光度检测使用上海物理光学仪器厂WZZ-2A型自动旋光仪。
1.2 实验方法1.2.1 酶源细胞的获得: 从平板上挑取一环恶臭假单胞菌TS1138接入种子培养基中, 28℃ 200 r/min培养16 h后, 以1%接种量转接到7 L产酶培养基中, 在10 L发酵罐中进行发酵培养, 发酵条件如下: 温度: 29℃; pH: 6.4~6.7; 转速: 400 r/min; 通气量: 200 L/h发酵16 h, 发酵液于4℃下6 000 ×g离心10 min, 弃去上清液, 菌体用PBS缓冲液(0.02 mol/L磷酸缓冲液, 0.15 mol/L NaCl, pH 7.4)悬浮洗涤, 4℃, 8000 ×g 离心10 min, 重复洗涤2次, 收集菌体称取湿重, 并加入PBS制得终浓度为25%(W/V)的酶源细胞菌悬液1.2.2 DL-ATC转化反应: 150 mL酶源细胞悬液中加入300 mL底物溶液(0.6% DL-ATC, 0.6% K2HPO4, 0.01%羟胺, pH 7.5~8.0), 混匀后置于42 ℃恒温水浴中反应2.5 h转化后离心分离酶源细胞及反应液, 酶源细胞经PBS重悬后用于下一次转化反应, L-半胱氨酸的转化液可用于进一步的氧化实验。
1.2.3 L-半胱氨酸和L-胱氨酸的含量测定: 采用Gaitonde法直接测定溶液中L-半胱氨酸的含量[10]再将溶液适当稀释后与等体积的2 mmol/L 1,4-二硫苏糖醇(DTT)溶液混合, 经NaOH调节pH值8.0至8.5, 室温下静置1h, 使溶液中的L-胱氨酸完全还原成L-半胱氨酸后再采用Gaitonde法测定其中L-半胱氨酸的含量, 两者之差即为L-胱氨酸的含量1.2.4 DL-ATC和L-胱氨酸的高效液相色谱法检测: 色谱柱: Nucleosil SA(250×4.6 mm), 进样体积: 20 mL流动相: 冰乙酸-三乙胺-水(0.1: 0.1: 99.8); 流速: 0.6 mL/min; 柱温: 25 ℃ELSD检测器参数: 漂移管温度40℃; 氮气压力: 2.8 Bar1.2.5 L-胱氨酸的分离纯化: 取经DMSO 氧化后的L-胱氨酸反应液, 上样于001×7型阳离子树脂柱(40 cm × 2.6 cm), 流速1.5 mL/min充分洗涤后以 1.0 mol/L氨水洗脱, 洗脱速度0.7 mL/min收集洗脱液, 并以上述1.2.3方法检测洗脱液中L-胱氨酸的含量。
合并活性洗脱峰, 以HCl调pH值至5.0, 析出胱氨酸白色粉末过滤收集上述粉末, 经少量无水乙醇洗涤, 烘干后进行纯度鉴定1.2.6 胱氨酸的旋光性鉴定: 分别称取分离纯化后的粉末和标准品各0.121 g, 溶解于5 mol/L、12 mL的盐酸中, 将溶液装入旋光仪的盛液管中, 进行旋光性测定, 计算其比旋光度 2 结果与分析2.1 微生物酶法转化DL-ATC生成L-半胱氨酸的转化效率采用微生物酶法单次转化DL-ATC后, 离心取上清液, 以Gaitonde法测得溶液中L-半胱氨酸浓度为 3.21 g/L (摩尔浓度0.027 mol/L), 经计算从底物DL-ATC到产物L-半胱氨酸的摩尔转化率达到了96.83%2.2 L-半胱氨酸氧化条件的考察2.2.1 氧化剂的考察: 取一定量的上述转化液, 分别加入不同剂量的DMSO或H2O2, 用HCl调节pH为1.0, 室温氧化8 h后, 再分别测定L-半胱氨酸氧化率及L-胱氨酸生成率如图1所示, 当DMSO的浓度在2%, L-半胱氨酸的氧化率均可以达到97.4%, 而L-胱氨酸的生成率可以达到91.6%而H2O2 为强氧化剂, 当浓度在1%以上时L-半胱氨酸的氧化率均可以接近99%, 但所得到的胱氨酸会被进一步氧化为磺基丙氨酸[11], 从而导致胱氨酸生成率几乎为零。
图1 L-半胱氨酸氧化剂的考察Fig. 1 Test of oxidizing agents for L-cysteine以DMSO为氧化剂时L-半胱氨酸的氧化率(○)和L-胱氨酸的生成率(●); 以H2O。