TRIZOL 试剂警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤接触皮肤之后立即用去垢剂和水 冲洗若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）收到药品后，在室温下存储以已证明 TRIZOL 在常温下可稳定储存 12 个月说明：TRIZOL 是一种从细胞和组织中提取总 RNA 的现用试剂该试剂是一种苯酚 异硫氰酸酯单相溶液，它发展自 Chomczynski 和 Sacchi 的 RNA 一步抽提法在 细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整 性离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相RNA只留在水相中转移水相 后，用异丙醇沉淀回收RNA除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后 续沉淀方法回收用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质DNA 的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至 50-100mg， 高至〉lg和细胞（低至5x106，高至〉107）都有良好的效果其简单的操作方法 允许同时处理大量样品整个过程可在1小时内完成用TRIZOL提出的总RNA 不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern电泳分析、斑点杂交、poly （A）+选择、 体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
在PCR和扩大DNA酶I梯度分离中， 建议使用一个内含子中的两个引物TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离例如，从鼠肝分离 的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA 条带，（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb （28S）和2kb （18S）核糖体RNA 的条带，以及介于0.1到0.3kb （tRNA, 5S）的小分子RNA的条带所分离的RNA 稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8谨防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase由于其活性难以 抑制，因此只能直接避免其引入在处理RNA时需要注意以下规则戴一次性手套皮肤上往往沾有污染 RNA 的细菌或霉菌，并成为 RNase 的 来源训练良好的微生物学操作方法以避免微生物污染使用无菌的一次性塑料实验用品和移液枪进行 RNA 操作，避免公共用具的 Rnase交叉污染例如，用RNA探针的实验室一般会用到RNaseA或T1以降低滤 器背景，而任何不能丢弃的实验用品（如移液枪）可能沾有大量的 RNaseATRIZOL可以有效防止RnaseA污染下游样品的处理需要无RnaseA得玻璃 或塑料器皿。
玻璃器皿应该在150°C下烘烤4小时，塑料制品应用0.5M的NaOH 浸泡 10 分钟，再用水充分冲洗，最后高压灭菌其他注意事项：在装2ml体积的TRIZOL时，建议用透明的一次性聚丙烯管用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并试验其能否经受1200gTRIZOL的 离心力以及氯仿的腐蚀不要使用泄露或有裂缝的管子离心前小心地称重平衡离心前玻璃管需用石蜡膜封闭管口，聚丙烯管必需加盖RNA 分离技术指南警告：使用 TRIZOL 时一定要戴手套和护目镜避免接触皮肤或衣服在化 学通风橱操作，避免吸入其蒸气除特殊情况外，试验操作及试剂存储温度都要求在15-30°C需要但无需补充的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（用于焦碳酸二乙酯处理水）不含RNase水或0.5%SDS溶液（不含RNase水的配制：将水加入不含Rnase 玻璃瓶，添加焦碳酸二乙酯至0.01%（v/v）,静置过夜，高压灭菌；SDS溶液的配 制要用焦碳酸二乙酯处理的无菌水1．匀浆化a. 组织每50-100mg组织加入lmlTRIZOL在玻璃管中用电力匀浆机匀浆化 取样容积不能超过用于匀浆化的 TRIZOL 的体积的 10%b. 单层培养细胞将lmlTRIZOL加入3.5cm培养皿，用移液枪吹打几次，直接将细胞消 化。
TRIZOL的加入量取决于培养皿的体积（每10cm2加1ml）,而非 细胞数如果加入不足会造成提取RNA被DNA污染c. 悬浮培养细胞离心沉淀细胞在TRIZOL中反复吹打使细胞消化每5-10x106个动 物、植物或酵母细胞或每5-10x106个细菌细胞加1ml消化剂在加入 TRIZOL之前先不要洗细胞，因为这会促进RNA的降解如果需要破 碎酵母或细菌细胞就要用到匀浆器任选：当处理样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材 料如肌肉、脂肪组织、植物的块茎部分等时，还需要添加额外的分离步骤 均一化结束后，在2-8C下以12000g离心10分钟从匀浆中除去不容部分 该部分含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中脂肪组 织样品需要将上层过剩的脂肪收集除去每次都将清除过得匀浆液转移到 新管中，加入氯仿，按前述步骤分离固液相2．相分离将经过匀浆化处理的样品在15-30C下孵育5分钟，使核蛋白复合体 完全分离每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿，小心加盖用手剧烈震管子15 秒，然后在15-30C孵育2-3分钟在2-8C下以最高12000g离心力离心 15分钟，混合物分为成下层红色苯酚-氯仿相、相界面和上层无色水相。
RNA 只存在于水相水相体积约占均一化 TRIZOL 试剂体积的 60%3. RNA沉淀将水相转到新管，如果需要分离DNA或蛋白质的话保存有机相向 水相加入异丙醇沉淀RNA,每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇在15-30C 下孵化样品10分钟，在2-8C下以最高12000g离心力离心10分钟通常 不可见的RNA在离心后在管底形成胶状沉淀4. RNA 洗涤弃去上清用 75%乙醇洗涤 RNA 一次，每 1ml 每 1mlTRIZOL 加 Iml75%乙醇涡旋混合样品，并在在2-8°C下以最高7500g离心力离心5 分钟5．再溶解 RNA结束时简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟）不要 用真空离心的方法干燥RNA防止RNA完全干燥非常重要，因为那样会 明显降低RNA的溶解性部分溶解RNA样品使其A26o/28o比＜ 16加 入无RNase水或0.5%的SDS溶液，用移液枪吹打几次，在55-60C下孵 育10分钟，溶解沉淀如果RNA要用于酶促反应，就要避免加入SDS RNA也可以溶于100%的甲酰胺（去离子），-70C保存RNA 分离注意事项：1. 从少量组织（1-10mg）或细胞（102-104）样品中分离RNA：向组织或细胞 中加入800plTRIZOL,用相同的方法加入氯仿按照相分离第二步操作。
用 异丙醇沉淀RNA之前，先加入5-10yg淀粉作为转入水相的载体为降低 粘度，在加入氯仿之前现用26计量注射针剪切基因组DNA淀粉留在水 相与 RNA 一起沉淀出来当浓缩至 4mg/ml 时淀粉不会抑制单链合成和 PCR2. 匀浆化之后加入氯仿之前，样品可以存于-60到-70C至少一月RNA沉 淀（第四步，RNA洗涤）可以保存在75%乙醇2到8C下至少一周或-5 到-20 C下至少一年3．如果第二、三步的离心时间可以达到 30-60分钟，最高可达2600的台式 离心机也适用于本实验方案DNA 分离技术指南如RNA分离实验所述，完全除去水相之后，存在于相界面和酚相的DNA就 可以从原来的匀浆中分离出来经过沉淀和一系列的洗涤之后，将DNA溶于8mM 的NaOH溶液TRIZOL可以回收组织或培养细胞的全DNA，因而它可用于测定 待分析样品的DNA含量同时抽提基因组DNA，使每个基因组对应的Northern 分析结果归一化成为可能，避免了总 RNA 或组织重量变化的影响基于不同来 源，有的 DNA 沉淀在使用之前可能还需要进一步的纯化（如酚抽提）需要但无需补充的试剂：乙醇0.1M柠檬酸钠溶于10%乙醇75%乙醇8mM 的 NaOH1 ．DNA 沉淀除去留在相界面以上的水相，用乙醇沉淀相界面和有机相中的DNA。
每 1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL,加0.3ml无水乙醇，倒置混匀然后在 15-30C下存储2-3分钟，在2-8C下以最高2000g离心5分钟沉淀DNA小心除去水相对分离DNA的品质非常重要2．DNA 洗涤除去上层的酚-乙醇，如果需要的话保留以备蛋白分离在含0.1M柠檬 酸钠的10%乙醇中洗涤DNA两次，每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加 lml洗涤溶液每次洗涤，都将DNA沉淀在洗液中15-30°C下保存30分钟（周 期性混合），并在2-8C下以最高2000g离心5分钟两次离心之后，将DNA 沉淀在 75%乙醇（每 lml TRIZOL ,力口 1.5-2ml75%乙醇）15-30C下保存 10-20 分钟（周期性混合），并在2-8C下以2000g离心5分钟DNA含量高于200腿的沉淀或大量不含DNA的样品都需要在0.1M钠 的 10%乙醇溶液中再洗涤一次3．再溶解 DNA在开放的管中空气干燥 DNA5-15 分钟不要用离心干燥，因为那将造 成溶解困难用8mM的NaOH溶解DNA至终浓度为0.2-0.3pg/pl从107 细胞或50-70mg组织中分离的DNA需要加300-600pl8mM的NaOH。
建议将 DNA 重悬于弱碱，因为分离的 DNA 不易重悬于水或 Tris 缓冲液 8mM 的 NaOH溶液pH约为9, DNA溶解后应该很容易用TE或HEPES调节在该 阶段，DNA样品（尤其是源于组织的）可能会含有不溶性胶状物质（细胞膜 碎片等）用12000g离心10分钟除去不溶物，将含DNA的上清移至新管 溶于8mM的NaOH的DNA可以在4C保存过夜；如果需要延长储存时间， 就需要用HEPES调节pH至7-8 （见表），并补充1mM的EDTA调好pH 后, DNA可保存于4C或-20CDNA的定量和期待产率取一部分溶于8mM的NaOH的DNA样品溶液，与水混合，测定所得溶液的 A26o用双链DNA的A260值计算其含量，一个A260单位相当于50腿双链DNA/ml 要计算分析样品的细胞数时，可以假定每个人、大鼠、小鼠的二倍体细胞的DNA 含量分别为：7.1yg、6.5yg、5.8yg应用：用PCR扩增DNA： 用 8mM的NaOH再溶解DNA后，用0.1mM的HEPES 调节pH至8.4 （见表）加0.1-1.0yg样品到PCR反应混合液，执行标准的PCR 反应限制性内切反应：用HEPES调节DNA溶液pH至预定值（见表），也可以选 择用1mM, pH7-8的EDTA透析样品。
每微克DNA用3-5单位酶个别酶条件依 照厂家建议，让反应进行3-24小时在典型的测试试验中，80-90%的DNA是可 消化的DNA样品溶解的8mM NaOH的pH调节：（1ml8mM 的 NaOH 需用 0.1M 或 1MHEPES 的量）Final pH0.1 M HEPES @l)Final pH1 M HEPES (yl)8.4867.2238.2937.0328.01017.81177.5159DNA 分离注意事项：1. 酚相和相界面可在2-8C保存过夜2. 悬于75%乙醇的样品可在2-8C保存数月3 .溶于8mM的NaOH的样品可在2-8C保存过夜需要更长保存时间的话, 要将pH调至7-8，并将EDTA浓度增至1mM蛋白质分离技术指南蛋白质分离自用乙醇沉淀DNA之后的酚-乙醇相（DNA再沉淀第一步）所 的样品可以用于WB分。