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1、Apoptin基因诱导A375细胞凋亡信号转导机制 肿瘤特异性凋亡基因；细胞；凋亡；半胱天冬蛋白酶,摘要： 目的研究肿瘤特异性凋亡基因(apoptin)在诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡中的信号转导机制。方法用含有apoptin基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色素瘤细胞A375；采用RT-PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪分析检测A375的细胞的凋亡；以比色法检测半胱天冬蛋白酶8(caspase-8)和caspase-3的相对活性。结果Apoptin基因瞬间传染的A375细胞可出现典型的细胞凋亡所具有DNA梯状带；流式细胞术发现实验组细胞凋亡率明显高于其他各组(P关键词：肿瘤特异性凋亡基
2、因；细胞；凋亡；半胱天冬蛋白酶Study on signal transduction in apoptosis of human melanoma cells A375 induced by apoptinLab of Molecular Biology,Center for Disease Control and Prevention,Shenyang Military Command(Shenyang 110034,China)Abstract： ObjectiveTo study whether apoptin gene induces apoptosis in human melan
3、oma cells A375 via the activation caspase-8 and caspase-3.MethodsThe human melanoma cells A375 were transiently transfected with recombinant pcDNAA3 plasmid,which contained apoptin gene,and the apoptosis was measured by DNA agarose electrophoresis,RT-PCR and flow cytometry.Caspase-8 and caspase-3 re
4、lative activity was analyzed by colorimetric assay at various time.ResultsThe apoptin gene could induce apoptosis of human melanoma cells A375in vitro and the mRNA of apoptin gene could be detected by RT-PCR.The activity of caspase-3 began to rise in A375 cells after transfected withapoptin gene,but
5、 that of caspase-8 did not change.ConclusionApoptin gene can induce apoptosis in human melanoma cells A375via active caspase-3.Key words： apoptin;cell;apoptosis;caspase细胞凋亡是一种机体为维护正常组织形态、体积及功能而与细胞增殖相平衡的主动自杀过程；凋亡发生异常，会导致细胞无限增殖而致癌变发生。在对凋亡机制的研究中，陆续发现了一些诱导细胞凋亡的酶类，其中半胱天冬蛋白酶(caspase)是细胞凋亡的关键分子，细胞凋亡的形态变化是系
6、列caspase活化并水解底物的结果。近年来研究发现，Apoptin可通过独立于p53作用途径、不被Bcl-2过量表达所抑制的方式，特异性诱导人类多种肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，但并不作用于正常细胞1，2。本研究前期克隆和构建了apoptin基因真核表达载体，并证明该载体对人黑素瘤细胞A375具有明显的凋亡诱导作用3，4。在此基础上，为了进一步探讨apoptin基因诱导肿瘤细胞凋亡机制，本文探讨apoptin基因在诱导肿瘤细胞A375凋亡时cpspase-8和caspase-3的活性变化。1材料与方法11材料Lipofectmina、凋亡细胞DNA提取试剂盒(美国Invitogen公司)；溴化丙
7、啶(PI)和RT-PCR试剂盒(美国Sigma公司)；caspase-8检测试剂盒(美国Calbiochem-Novabiochem公司)和caspase-3底物AC-DEVD-pNA(英国Alexls公司)；流式细胞仪(美国Coulter公司)；550型酶标免疫测定仪(瑞典Bio-Rad公司)。其他化学试剂均为国产分析纯。质粒pcDNAA3由本室构建，内含肿瘤特异性凋亡基因，采用硷变性法大量提取质粒DNA，用PEG沉淀法进行纯化，所得质粒DNA含量为2g/L，纯度达到电泳纯5。人黑色素瘤细胞A375引自军事医学科学院。12方法121细胞瞬间转染参照Lipofectamin转染说明书进行。转染
8、前24h，将A375细胞重铺在T25培养瓶中，待细胞长至底面积80%时，进行转染。将10l DNA和20l Lipofectamin各加入500l无血清(DMEM)中，轻轻震荡5min，将二者混合即成转染液。室温静置20min，用无血清DMEM洗细胞2次，加入5ml无血清的DMEM，逐滴加入转染液，边加边轻轻混合，置37孵育8h。弃去转染液，换含100ml/L新生牛血清的DMEM培养液，继续培养。分别于转染后的不同时间，观察并取转染细胞进行鉴定，用等量的pcDNA31空质粒作转染对照。122RT-PCR鉴定取1106个转染不同时间的A375细胞，按异硫氰酸胍一步法，提取总RNA，作为RT-PC
9、R的模板，用RT-PCR扩增Apoptin cDNA6。123凋亡细胞DNA鉴定DNA凝胶电泳，取1106个A375细胞，加入500l细胞裂解液(10mmol/L Tris-HCL pH74、10mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、150mmol/L NaCl、5g/L十二烷基硫酸钠(SDS)及400mg/L蛋白酶K)，于50作用3h，不时振摇。加入等体积的平衡酚、氯仿-异戊醇抽提后，以2500r/min离心10min，加25倍无水乙醇沉淀。用700ml/L乙醇沉淀、干燥后，将DNA溶入40l TE液中，加入20l的10g/L Rnase，37水浴30min。取30l DNA，进行15g
10、/L琼脂糖凝胶电泳，细胞发生凋亡时可出现梯形条带。124apoptin基因诱导A375细胞凋亡的流式细胞术检测转染后24，48和72h，收集各组细胞于离心管中，用PBS洗2次，加-4预冷的乙醇振荡、固定后，于4保存过夜；用PBS洗2次弃固定液；200l RNA酶(RNaseA)震散，于37水浴中30min后，加800l溴化丙啶(PI)染色液，混匀，于4避光30min。在活细胞状态下，PI可与凋亡细胞结合，在荧光照射下发红光。400目尼龙网过滤后，用Elite流式细胞仪检测每份样品中的10000个细胞，观察激发波长488nm处的红色荧光。125caspase-8活性的检测按试剂盒方法进行。收集各实验组的细胞(2106)，加40l细胞裂解缓冲液，冰浴20min，反复冻融4次，待细胞完全破碎后，于4以15000r/min离心5min。收集上清，与200mol/L的底物(IETD)-pNA混匀，加于微量96孔板中，终体积为100l/孔，于25温育6h后，用酶标仪测定波长405nm的吸光度(A)值。结果以A405值(即底物中对硝基苯胺pNA的释放量)表示caspase-8的活性。
