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1、试剂盒提 DNA 的原理基因组 DNA 提取试剂盒简介DNA 是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验，获得高分子量和高纯度的基因组 DNA 是非常重要的前提，因此基因组DNA 的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。Solarbio 公司提供各种不同样品基因组 DNA 提取试剂盒，如植物、动物、细菌、细胞、血液、酵母等基因组DNA 提取试剂盒。所提取的基因组纯度高，片段大小在 50kb 左右。用户可根据需要选用不同的 试剂盒来进行不同样品的抽提。一、基因组 DNA 提取的原则1、保证核酸一级结构的完整性
2、 (因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层 )。2、排除其它分子(如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染，使 下游试验顺利进行。二、基因组 DNA 提取的原理和方法DNA 与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色丝，染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取 DNA 必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与 DNA 结合的组 蛋白及非组蛋白。1、样品预处理从各种不同来源的样品 ( 如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等 )中提取高纯度的基因组 DNA，
3、因细胞结构及所成分不同，样品预处理方式也不同，以下简单介绍常用提取材料的预处理方式，若需详细了 解，请参考本公司各基因组 DNA 提取试剂盒说明书。部分样品预处理方式植物材料液氮研磨动物材料匀浆、液氮研磨培养细胞蛋白酶 K 处理 细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液红细胞裂解液去红细胞2、细胞裂解CTAB 法：适用于植物组织、真菌等。CTAB 是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中(0.7M NaCl) 是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。SDS 法：适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。SDS
4、 是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、 染色体解析。其它裂解方法：物理方式：机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等 化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解等酶法：蛋白酶 K3、DNA 分离纯化纯化要求：核酸样品中不应存在对酶(如核酸内切酶、DNA 聚合酶等)有抑制作用 的成分。其它生物大分子如蛋白质、多糖、多酚和脂类分子等污染应降低到最 低程度。排除其它核酸分子的污染，如提 DNA 时应去除 RNA，反之亦然。纯化方法：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化 DNA ，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。因硅基质材料可特异吸附核酸 DNA，使用方便、快捷，不需要使用有毒溶
5、剂如酚、氯仿等，使得提取基因组像过滤一样简单，因此硅基质材料成为大规模分离纯化 DNA 的通用方法。硅基质材料吸附核酸的原理：主要利用 DNA 在高盐低 pH 值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高 pH 值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅石破坏了基质和 DNA 之间的吸引力， 因而 DNA 从硅基质上被洗脱下来。注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破 坏。减少化学物质对 DNA 的降解，为避免过酸、过碱对 DNA 双链中磷酸二 酯键的破坏，操作多在 pH 值 4.0-10.0 的
6、条件下进行。防止基因组 DNA 的生物降解，主要是 DNase 降解基因组 DNA，DNase需二价金属阳离子如 Mg2+ 等的激活，可用 EDTA 等金属离子螯和剂螯 和 Mg2+ 以抑制 DNase 的活性。减少物理因素对 DNA 的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力 (如剧烈振荡、搅拌等)，细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂， DNase 大量释放，样品反复冻融和高温等。4、DNA 洗脱收集DNA 的洗脱效率取决于以下重要因素：洗脱液成分：采用硅基质膜吸附的 DNA，可将 DNA 在低盐高 pH 值条件下洗脱下来。pH 值在 7.0-8.5 之间洗脱效率较高，pH 值低于 7.0
7、 则洗脱效率很低。一般基因组提取试剂盒中的洗脱缓冲液就是 TE(pH8.0) ，既为 DNA 从硅基质膜上洗脱下来提供良好的 pH 环境，其中的 EDTA 又能保证 DNA不被 DNase 降解，同时由于 EDTA 浓度非常低，对核酸内切酶、DNA 聚合酶的影响非常微弱，不影响后续试验，可放心使用。洗脱液体积：当洗脱液体积小于 30ul 时，洗脱效率很低且不稳定；当洗脱液体积在 50-200ul 时，洗脱效率稳定在 80-90，并可保证得到最大产量， 因此洗脱液体积不能小于 30ul。加洗脱液部位：100-200ul 洗脱液能完全覆盖硅基质膜，DNA 的洗脱量可得到保证，但当洗脱液体积较少如
8、30-50ul 时，须在硅基质膜中间部分悬空滴加 洗脱液，以确保少量的洗脱液能完全覆盖硅胶膜。洗脱液的温度：在加洗脱液之前，先将洗脱液在 60-75水浴中预热 10 分钟，可有 效提高 DNA 的洗脱效率。洗脱时间和次数：加入预热的洗脱液后，可在室温放置 2-5 分钟使 DNA 完全溶解在洗脱液里通过离心而洗脱下来。同时可进行二次或三次洗脱，即将前次洗脱下来的洗脱液再上柱、离心，使前次没有洗脱下来的 DNA 再次溶解 在洗脱液里，从而提高 DNA 的产量。5、DNA 的定量及检测提取得到的 DNA 片段需从分子质量、浓度、纯度等方面进行检测，从 而判断 DNA 质量。用琼脂糖凝胶电泳分析 DN
9、A 分子质量：得到的基因组 DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。Solarbio 公司的基因组 DNA 提取试剂盒提取的不同材料基因组 DNA 片段大小一般在 50kb 左右，能很好地满足后续试验的要求。通常用琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 分子质量时，以溴酚蓝为示踪染料，EB 染色，紫外观察，并与 DNA 分子量标准对照即可判断所提 DNA 的平均分子量。高质量的基因组 DNA 应显示为单一条带，如 DNA 降解则 表现为弥散条带。用紫外分光光度计检测 DNA 浓度和纯度：浓度测定：DNA 在 OD260 处有显著吸收峰，OD260 值为 1 相当于大约 50ug/m
10、l 双 链 DNA。以下简单介绍 OD260 的测定方法：所提基因组 DNA 样品=100ul进行 OD260 值测定的待测样品 =20ul 所提基因组 DNA 样品 +180ul TE=200ulDNA 稀释倍数=200ul/20ul=10 倍如 200ul 待测样品 OD260 值=0.2待测样品浓度(即 100ul 基因组 DNA 样品浓度)=50ug/mlOD260 值 稀释倍数=100 ug/ml所提 100ul 基因组 DNA 样品总量=100 ug/ml100ul=10ug DNA 纯度测定：一般用 OD260/OD280 值检测 DNA 样品的纯度。正常 OD260/OD280
11、 值约为 1.7-1.9 ，说明 DNA 纯度较好；若 OD260/OD280 值小于 1.7，说明可能有蛋白污染；若 OD260/OD280 值大于 2.0，说明可能有 RNA 污染 或 DNA 已经降解。注：因为 pH 值和离子会影响光吸收值，因此洗脱时如不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，OD260/OD280 值会偏低，但并不表示纯度低。6、DNA 的储存储存溶液：DNA 为两性解离分子，在碱性条件下较稳定，因此一般用 TE(pH8.0)保存。TE 的成分为：10 mM Tris-HCl(Tris 与盐酸形成强的缓冲对)；1 mM EDTA(乙二胺四乙酸，能螯合二价金属阳离子，抑制 DNase 的活性)；pH8.0( 碱性条件可减少 DNA 的脱氨作用，防止降解)。ddH2O 的正常 pH 值为 7.0 ，可作为 DNA 的储存液，但有些试验室制备的 ddH2O呈酸性(pH 值小于 7.0) ，这不仅影响 DNA 的洗脱效率，而且导致长时间保存的 DNA 容易发生降解。因此建议用 TE 作为 DNA 的长期储存液。 储存条件：为避免 DNA 降解，提取的 DNA 应先进行分装，然后置于-20 或-70 保存，同时注意避免反复冻融造成 DNA 降解。文章链接 ：中国化工仪器网http:/
