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1、 大 学毕 业 论 文醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化Breeding of Acetic Acid Bacteria and the Optimization of Process Conditions2011年 6 月 01 日烟台大学醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化烟台大学毕业论文任务书院（系）：化学生物理工学院姓名毕业论文题目醋酸菌的诱变育种及工艺条件的优化指导教师具体要求(主要内容、基本要求、主要参考资料等)：1）认真查阅相关资料，弄清实验目的、意义，搞好整体设计2）认真探索实验方法，找出实验的关键3）熟练实验操作技术，保证实验数据的准确性4）实验数据真实可靠，文献引用要合理，论文撰
2、写要规范主要参考文献：1 冯 静, 施庆珊, 欧阳友生, 陈仪本. 醋酸菌多相分类研究进展. 微生物学通报 SEP 20, 2009, 36(9): 1390-1396. 2 M. Ameyama, E.Shinagawa, K.Matsushita and Adachi: Agr.Biol.Chem, 2010, 48: 3099进度安排：第12周：确定论文题目，布置文献查阅相关事宜。阅读、整理文献，写开题报告。 第34周：进入实验室，熟悉环境、实验仪器。 第512周：预试验。正式试验，及整理实验数据。 第1314周：论文初稿。第15周：论文修改及定稿。指导教师（签字）： 年 月 日院（系）
3、意见： 教学院长（主任）（签字）： 年 月 日备注： 摘要 本实验从陕西农家醋醅和实验室自制果醋中分离得到两种菌种A1和B，以其为出发菌种，进行诱变以期得到高产酸量的菌株。结果表明：采用紫外诱变处理，得到A11和B11菌株，分别比亲株产酸量提高18 %和4.9 %。因起始酒精度、发酵温度、溶氧量（摇床转速）对醋酸菌的发酵产量有较大的影响。故对A11和B11菌株进行单因素优化，最终得到的最佳条件是：A11 ：初始酒精含量5 %、摇床转速150 r/min、发酵温度28；B11 ：初始酒精含量6 %、摇床转速150 r/min、发酵温度30。关键词：醋酸菌；分离；紫外线（UV）诱变；单因素试验Ab
4、stract: In this study, we got two kinds of strains, A1 and B, from Shan xi peasant vinegar and laboratory fermented homemade fruit vinegar in the experiment. Started by them as bacteria, we hope to get strains that could make high yield on acid consumption. The results show that: we got A11 and B11
5、strains by the ultraviolet mutation processing, and their consumption of acid increased by 18% and 4.9 %. Starting alcohol degrees, fermentation temperature and oxygen (the speed of the wave bed) have great influence on the acetic acid bacteria fermentation yields. We made single factor optimization
6、 on A11 and B11 strains, and we got the best condition is: A11: 5 % of the initial alcohol content, rotation speed 150 r/ min, fermentation temperature 28 ; B11: 6 % of the initial alcohol content, rotation speed 150 r/min, fermentation temperature 30 . Key words: acetic acid bacteria, separation, u
7、ltraviolet (UV) mutagenesis, single factor testII目录1 前 言11.1 概述11.1.1 醋酸菌的简介11.1.2 醋酸菌的培养及保藏11.2 诱变育种11.2.1 物理诱变紫外线诱变21.2.2化学诱变甲基磺酸乙酯(EMS)诱变21.3 醋酸菌生产性能的研究进展31.3.1 影响醋酸菌生长的生态因子31.3.2 生产性能的有关研究31.4 果醋的营养保健功能41.5 研究的目的和意义41.6 课题创新点42 材料与方法52.1 主要材料52.1.1 样品52.1.2 醋酸菌培养基52.1.3主要仪器设备52.2 主要操作方法52.2.1醋酸菌
8、的分离与纯化52.2.2 诱变方法52.2.3 单因素试验62.2.4醋酸菌的鉴定及检测方法72.2.5 醋酸菌的生长曲线73 结果与分析83.1 醋酸菌原始菌株的筛选83.1.1 分离筛选83.1.2 醋酸菌菌株的定性鉴定83.1.3醋酸菌生长曲线的绘制103.2 诱变育种113.2.1 紫外线诱变的菌株筛选113.2.2 EMS诱变的结果筛选153.3 醋酸菌产酸量的影响因素173.3.1 单因素试验设计173.3.2 单因素实验设计检验213.3.3 小结224 结 论23结论与展望24参考文献25致 谢26 烟台大学毕业论文1 前 言1.1 概述1.1.1 醋酸菌的简介醋酸菌是一大群革
9、兰氏染色阴性、严格好氧的细菌的总称。醋酸菌最显著的特征是，在有氧条件下，能将乙醇氧化为乙酸(Asia 属除外)。在将乙醇氧化为乙酸后，大部分醋酸菌还可进一步将乙酸或乙酸盐氧化为CO2 和H2O1。根据能否将乙酸盐和乳酸盐氧化为CO2 和H2O 的能力及鞭毛类型，将醋酸菌分为醋杆菌（Acetobacter）和葡萄糖氧化杆菌（Gluconbacter）2。醋酸菌具有多种形态特征，细胞从椭圆到杆状，单生、成对或成链排列。细胞大小为（0.8 m-1.2 m） （1.5 m-2.5 m）。细胞运动或不运动，若运动则具有周生鞭毛或极生鞭毛这两种类型鞭毛。专性好氧，是需氧细菌的代表，其中一些能产生色素或纤维
10、素3-6。1.1.2 醋酸菌的培养及保藏醋酸菌适宜的碳源是葡萄糖、果糖等六碳糖，其次是蔗糖和麦芽糖等，不能直接利用淀粉、糊精等多糖类。酒精、甘油和乳酸是极其适宜的碳源。培养醋酸菌的培养基需要含糖和酵母膏(VB)，另外添加酒精以适应代谢，加碳酸钙以中和其代谢所生成的醋酸，保证其繁殖的旺盛。常用培养方式有两种：（1）原菌试管培养，是将培养基做成试管斜面，接种后于30 -32 恒温培养箱内培养48 h，保存于0 -4 冰箱，一般在半月内传代一次。（2）三角瓶扩大培养，是将液体培养基装入三角瓶中，无菌操作加入酒精，每只试管斜面接3-4瓶于恒温培养箱培养5 d -7 d，也可摇床培养24 h，一般测定酸
11、度达到1.5 %-2 %即成熟。在食醋的生产中，醋酸菌菌种多半采用固体斜面的方式进行保藏。但是用这种方法保藏的醋酸菌退化快，生产性能也不稳定7-9。因此可以将菌种接入20 %甘油中，用冻干管零下20 保藏，如此可以保藏约六个月，可以防止多次传代引起的菌种退化。1.2 诱变育种诱变育种是通过诱变剂处理菌株，是当前菌种选育的一种重要方法10。提高菌种的突变率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。诱变育种和其他育种方法比较，具有速度快、收效大、方法简便等优点，在生产中应用极其广泛。但是诱发突变缺乏定向性11，因此诱发突变必须经过大规模的筛选才能得到显著的效果。诱变育种技术包括两个环节：一是
12、以合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使个体在恶劣环境中的变异频率大大提高；二是设计一种有效的筛选方法淘汰负向变异菌株，并把正变株中少数变异幅度最大的具有优良性状的菌株巧妙地挑选出来12。可以说目前工业上所用的高产菌株大部分都是通过这种方法获得的，而且这种方法在抗生素菌种改良中仍是方便、经济有效的，尤其适用于对那些遗传背景、生物合成途径还不甚清楚的抗生素产生菌；使用该法可以阻断不必要的酶活力，起到解除负调控、增加基因剂量的作用，不仅可使抗生素产量得到提高，而且可能使其利用原材料的成本得到降低。成功的诱变育种需要：1）处理可用于筛选的大的微生物群体；2）预
13、期的特性突变率高；3）可以用视力诊断或简单测定鉴别突变的有效方法。1.2.1 物理诱变紫外线诱变物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外线，而其此种诱变方法有很多先例，可以予以借鉴。用紫外线诱变醋酸菌，能使其产量有稳定的提高13。紫外线是波长136390 nm的短于紫外波长的射线，它是一种非电离辐射，能使被照射物质的分子或原子中的内层电子提高能级跃迁到能量高的外层轨道（称为激发），导致分子的理化变化。紫外线辐射最主要的则是引起DNA形成嘧啶二聚体，他会阻碍双链的解链和复制，阻碍碱基的正常配对，从而导致基因突变14。它的遗传效应主要是引起GCAT 的转换或移码突变。由于存在光复活作用，即白光照
14、射能活化光激活酶并将嘧啶二聚体解而使DNA恢复正常，故辐照和处理后的培养应避免可见光照射（应在红光下操作）15。 测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作为相对剂量）两种。微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射距离和时间16。如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的时间成正比，故照射时间的长短可作为相对剂量。一般用15W的紫外灯，距离固定在30 cm左右，挑选出致死率达到90 %99.9 %所需的辐射时间进行诱变处理。但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需要辐照35 min，芽孢要10 min，芽孢杆菌的营养体则要13 min，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用30 s，放线菌的分生孢子用30 s2 min 17。辅射同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。照射前紫外灯宜先开灯预热2030 m
