积雪草对HaCaT细胞及咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的作用及机制探讨 - 药学 药学论文 本文是一篇药学论文，本研究对积雪草不同组分进行初步的体外抗氧化活性初筛，并成功将其应用到 HaCaT 细胞炎症模型上，通过检测细胞内氧化应激水平、炎症因子和皮肤屏障相关因子基因叙述情况探究其对 HaCaT 细胞的爱护作用，并进一步考察了其对 HaCaT 细胞凋亡水平和炎症通路相关蛋白的调节作用最后，通过动物实验证明积雪草乙酸乙酯组分能够改善咪喹莫特乳膏诱导的银屑病小鼠症状，为积雪草组分的应用提供了实验依据第一章 绪论1.1 银屑病银屑病是一种由遗传和环境等因素共同诱发的慢性炎症性皮肤疾病，病因与发病机制尚未明确，主要以角质形成细胞过度增殖及免疫细胞在真皮及表皮的炎症浸润为主要病理生理学特征[1]近年来，全球范围内银屑病患病率日益回升，影响了近 2-3% 人群[2]银屑病患者承当着巨大的生理压力，皮肤瘙痒疼痛，甚至破裂出血，严重者不能自由活动此外，心理上也饱受煎熬，影响正常社交，生活质量下降由于银屑病发病病程比拟长久，并伴随着一系列并发症，目前的药物很难完全治愈银屑病，因此迫切需要对此类疾病进行预防与治疗，并寻找更加理想的药物[3,4]。
当代对于银屑病的研究主要集中在免疫系统失衡、慢性新血管生成以及表皮细胞过度增殖等方面[5]根据全基因组关联研究〔Genome wide association studies，GWASs〕证实，固有免疫和适应性免疫反馈紊乱是银屑病炎症发生和持续存在的主要原因[6]到目前为止，已经证实肿瘤坏死因子-α〔Tumor necrosis factor-α，TNF-α〕和白介素 23〔Interleukin 23，IL-23〕/辅助性 T 细胞 17〔T helper cell 17，Th17〕介导的相关途径在银屑病的发病机制中处于关键地位在银屑病皮损部位，IL-23 分泌增加，进一步刺激 Th17 细胞分泌大量细胞因子，如白介素-17A〔Interleukin 17A，IL-17A〕、IL-17F〔Interleukin 17F〕、IL-22〔Interleukin 22〕等，这些细胞因子通过作用于角质形成细胞，诱导其过度增殖同时当角质形成细胞活化后，可分泌出大量的炎症因子、趋化因子、抗菌肽等，这些因子会进一步浸润免疫细胞[2,7]其他免疫相关细胞，如辅助性 T 淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞也可以通过产生 IL-17A 或者其他机制对 Th17 细胞功能进行调控，这些结果都试图阐明以 IL-17A 为中心的发病机制。
1.2 银屑病发病机制细胞信号通路是指细胞通过细胞膜或细胞内的受体感受信息分子的刺激，继而通过产生各种免疫相关因子和炎症相关因子，对细胞代谢进行调控在一些外来因素刺激下，皮肤中的抗原呈递细胞与抗原相结合，这些活化的抗原呈递细胞进一步激活某些细胞因子叙述，这些细胞因子通过激活某些信号转导分子加剧炎症反馈，进而使银屑病样皮损持续发生[21]1.2.1 银屑病与 NF-κB 通路NF-κB 属于细胞内的一种初级转录因子，参与机体内多种生命活动，尤其是在免疫应答方面，且其活性在多个步骤中都受到严风格控[22]正常情况下，NF-κB 与其抑制因子 IκB 相结合，处于非活化状态[23]在某些外界因素刺激下，如〔TNF-α、IL-1、IL-17、病毒和脂多糖〕，IκB 磷酸化并解离出来，此时 NF-κB 由细胞质进入细胞核内，与某些基因调控序列结合，对下游的分子进行调控[24,25]NF-κB 对银屑病的影响不仅通过调动细胞内各种炎症因子、趋化因子、淋巴因子，还通过影响角质形成细胞的增殖与分化水平发挥作用[26-28]研究说明，在银屑病患者皮损部位的内皮细胞中，NF-κB p65 染色明显增加，这说明活化的 NF-κB 水平与银屑病的病程息息相关[29]。
Janus 激酶〔Janus kinase，JAK〕对细胞因子介导的相关信号转导具有重要作用迄今为止，4 种 JAK 亚型已被鉴定，即 JAK1、JAK2、JAK3 和酪氨酸激酶 2〔TYK2〕当一些生长因子和细胞因子激活 JAK，JAK 激活后进一步导致信号转导及转录激活因子〔Signaltransduction and activator of transcription，STAT〕磷酸化，而 STAT 是一类 DNA 结合蛋白，能够结合下游靶基因进而调控细胞的增殖、凋亡和分化水平STAT 共有 7 个家族成员，其中，STAT3 与银屑病的发生开展最为密切[33,34]相关研究说明，与健康小鼠皮损组织相比，银屑病小鼠皮损组织中 STAT3 叙述水平上调，且通过抑制 STAT3 信号通路相关因子叙述能改善咪喹莫特乳膏诱导的银屑病小鼠症状[35]第二章 材料与办法2.1 实验材料2.1.1 实验仪器表 2-1 主要仪器与生产厂家 ...........................2.2 实验办法2.2.1 积雪草不同组分提取别离取 40 g 枯燥积雪草〔由云南中医药大学俞捷教授鉴定并馈赠〕，粉碎，按料液比 1:15 参加 600 mL 60% 乙醇溶液，浸泡 15 h，40oC 超声 1 h，过滤，收集滤液，滤渣重复上述过程两次，合并滤液，旋蒸得小体积浓缩液，将浓缩液均分两份，一份冷冻枯燥，得乙醇组分；另一份依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，合并萃取液，旋蒸得到小体积浓缩液，用少量二氯甲烷复溶正己烷、乙酸乙酯萃取物，挥干，得正己烷组分、乙酸乙酯组分；用少量去离子水复溶正丁醇、水相萃取物，冷冻枯燥，得正丁醇组分、水相组分。
将各种组分用 DMSO 溶液配制成 50 mg⸱mL-1 的母液备用，整个提取过程如图 2-1图 2-1 积雪草 5 种组分提取流程图...................................第三章 结果与讨论 ....................................... 193.1 积雪草不同组分的提取率 ............................................. 193.2 积雪草不同组分总黄酮含量测定结果 .................................. 193.3 积雪草不同组分总多酚含量测定结果 ..................................... 19主要结论与展望 ........................... 40主要结论 ........................................... 43展望 ..................................... 43第三章 结果与讨论3.1 积雪草不同组分的提取率提取积雪草不同组分，提取率如表 3-1 所示，由表可知，积雪草不同组分的提取率为乙醇组分最高，水相组分、正丁醇组分次之，其后为乙酸乙酯组分，正己烷组分的提取率最低。
表 3-1 积雪草 5 种组分提取率........................主要结论与展望主要结论本研究对积雪草不同组分进行初步的体外抗氧化活性初筛，并成功将其应用到 HaCaT 细胞炎症模型上，通过检测细胞内氧化应激水平、炎症因子和皮肤屏障相关因子基因叙述情况探究其对 HaCaT 细胞的爱护作用，并进一步考察了其对 HaCaT 细胞凋亡水平和炎症通路相关蛋白的调节作用最后，通过动物实验证明积雪草乙酸乙酯组分能够改善咪喹莫特乳膏诱导的银屑病小鼠症状，为积雪草组分的应用提供了实验依据主要结论如下：〔1〕积雪草不同组分的总黄酮和总多酚含量存在差别，乙酸乙酯组分所含总黄酮和总多酚含量最高，分别为 182.76 μg·mL-1 和 88.08 μg·mL-1，其次为正丁醇组分体外抗氧化能力显示，积雪草正丁醇组分和乙酸乙酯组分的抗氧化能力明显优于其余组分〔2〕在&nb 12 药学论文 sp; HaCaT 细胞炎症损伤模型中，积雪草不同组分能明显提高细胞内 GSH 和 SOD 含量，并去除过量的 ROS。
实验结果说明，积雪草乙酸乙酯组分效果最正确，与模型组比拟，在高浓度下，乙酸乙酯组分对 GSH、SOD 的促进作用分别为 130.90% 和 93.00%；对 ROS 的抑制作用为 86.26%此外，ELISA 实验结果显示，积雪草不同组分显著抑制细胞上清液 IL-6 和 MMP1 分泌，且 5 个组分能有效下调炎症因子〔IFN-γ、CCL20、IL-6 和 TNF-α〕，胶原酶降解相关因子〔MMP1 和 MMP3〕并提高屏障爱护因子〔AQP3 和 FLG〕基因叙述水平，以乙酸乙酯组分和正己烷组分效果最正确流式细胞术结果显示，积雪草乙酸乙酯组分和正己烷组分能够促进细胞凋亡蛋白免疫印迹分析结果说明，积雪草乙酸乙酯组分和正己烷组分能抑制 NF-κB 和 JAK1-STAT3 相关通路蛋白的叙述，综合来看，积雪草乙酸乙酯组分对上述 2 条炎症相关通路的调节作用最强，并表现出一定剂量依赖性〔3〕在 5% 咪喹莫特乳膏构建的银屑病小鼠模型中，积雪草乙酸乙酯组分实验组小鼠皮肤红斑和褶皱减少，皮损程度减轻皮肤病理组织切片结果说明积雪草乙酸乙酯组分实验组小鼠表皮鳞屑根本消失，皮损处表皮厚度变薄，炎症浸润情况改善，且通过检测小鼠血清中和皮损组织中银屑病相关因子分泌水平发现，积雪草乙酸乙酯组分能明显抑制银屑病相关因子释放。
参考文献〔略〕 12 。