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1、农业生物技术课程论文 题 目 _转基因技术在玉米育种中的应用_ 院（系）：专业：班级：姓名：学号：成绩：完成日期：转基因技术在玉米育种中的应用摘要：玉米转基因育种是基因工程中基因转移的方法创造玉米新种质、种质资源或新品种。将转基因技术与玉米常规育种的方法与技术相结合，能尽快地培育出符合育种目标与市场需求的新品种、带来育种水平的提高、创新和突破、加快玉米育种进程。随着转基因技术的飞速发展及其研究的日趋成熟，转基因技术在拓宽玉米种质资源，提高杂交种的抗逆性、抗病虫性、提高产量和品质等方面将发挥更大的作用，应用前景广阔。 关键词：玉米、育种 转基因技术、基因工程植物转基因技术是指利用重组技术、细胞D
2、NA培养技术或种质系统转化技术将目的基因导人植物基因组，并能在后代中稳定遗传，同时赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。常规育种常常受有性杂交亲和性的制约，而利用转基因技术可以打破物种界限、克服有性杂交障碍，快速有效地创造遗传变异，培育新品种、创造新类型，大大缩短新品种育成的时间。因此，随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术也蓬勃发展。 玉米是重要的粮食作物，也是用基因工程方法进行品种改良的作物。随着世界首例转基因烟草于1983年培育成功，全球范围内开展了转基因玉米研究。育种者利用转基因技术可以对有益的基因进行有目的的操作，并且可以跨越天然物种屏障把来自其他生物的基因导入
3、到与其毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞中，以获得所需要的理想性状，缩短选育周期，从而培育出高产、优质、多抗的作物新品种。目前，转基因技术在玉米的遗传育种中得到广泛应用并取得了较好的成效。玉米转基因已经建立了一套比较完整的理论和技术体系，其技术主要包括：以农杆菌Ti质粒介导的载体转化技术、利用基因枪、PEG等的DNA直接导人转化技术和通过花粉管通道、子房注射的转化技术。转基因技术通过种属问基因的流动弥补了玉米遗传资源的不足，与常规育种结合必将带来育种上的重大突破，它是农业生物技术的核心领域，并将成为作物育种的一种重要手段。1 转基因玉米产业发展现状从产业化情况来看，近十年来转基因玉米发展十分迅速，
4、已成为全球推广面积第二的转基因作物。19962007年全球转基因玉米种植面积增加117倍，与转基因大豆种植面积的增幅基本相当（朱毅华，2008）。从相对地位来看，2007年转基因玉米占全球转基因作物播种面积的比例达到31%，居转基因作物种植面积第二位，仅次于转基因大豆(占51%)（刘源霞等，2007）。转基因玉米是世界上最重要的转基因作物之一。从各主要种植国来看，1999 年, 全球12 个国家种植的4 个主要转基因作物中, 玉米占转基因作物总种植面积的28% 。美国种植的转基因玉米( 抗虫基因Bt 和耐除草剂基因) 增加了220 万hm2, 从1998 年的810 万hm2 增加到1999
5、年的1 030 万hm2, 相当于1999 年美国全国玉米种植面积3 140万hm2 的33% 。美国科学家还培育出能抗欧洲玉米螟的转基因玉米, 以防欧洲玉米螟威胁玉米种植。到1998 年, 这种转基因玉米的种植面积已达到美国玉米种植面积的20%。此外, 抗根瘤线虫病的玉米新品种也已研制成功, 2 3 年内即可大规模栽培。除美国外, 欧盟的西班牙和法国也已开始种植转基因Bt 玉米, 面积分别为3 万hm2 和1 000hm2, 而葡萄牙首次在1999 年种植转基因Bt 玉米1 000 hm2 以上, 此外, 德国也有小面积的Bt玉米种植。转基因玉米种植面积迅速增长的一个重要原因是能有效提高玉米
6、单产水平。就玉米单产水平而言，世界各国之间存在着很大差异，玉米主产国之间单产增长幅度差异明显。在发达国家，如美国、法国和加拿大，玉米单产均在8吨/公顷以上的较高水平。与发达国家相比，我国玉米单产尚有较大差距，2006年仅为5.37吨/公顷，与阿根廷相近；而巴西、墨西哥、印度等国的玉米单产则处于较低水平（白云凤等，2003）。2. 转基因技术在玉米育种上的应用21抗虫转基因玉米 虫害是制约玉米产量的重要因素，目前，在玉米上解决虫害的主要方法是在玉米植株生长过程中使用化学杀虫剂。但是化学杀虫剂不但杀死害虫，也杀死害虫的天敌长此以往会造成生态平衡的破坏和环境污染的日益严重。种植转基因玉米是替代使用杀
7、虫剂的有效方法。目前, 抗虫转基因玉米主要应用的是BT 毒蛋白的基因和植物来源的抗虫基因( 蛋白酶抑制剂, 苏元菌, 芽孢杆菌剂基因、淀粉酶抑制剂基因和凝集素基因等) 。BT 在芽孢形成的过程中产生杀虫晶体蛋白( ICP) , BT 毒蛋白在体孢晶体内以原毒素的形式存在。被昆虫摄取后, 在昆虫幼虫的肠道内的微碱性条件下经蛋白酶水解转变为毒性多肽分子, 可与昆虫肠道上敏感的表面特异受体相互作用, 抗乱细胞的渗透平衡, 从而导致幼虫停止进食, 最终死亡。王国英等成功地利用基因枪法把BT 基因转移到玉米幼胚中, 再生植株中( ryIACb) 基因得到表达。美国孟山都公司和Ciba-Geigy 公司分
8、别改造合成了BT 杀虫毒蛋白基因, 并转入玉米, 1996 年美国正式批准BT 转基因玉米进入商品化生产, 当年推广面积达320 万hm2。目前, 转BT 抗虫玉米在美国等国家已经得到广泛应用。目前，中国转基因抗虫玉米尚处于田间释放阶段。22抗除草剂玉米抗除草剂基因工程是指将抗除草剂耐性基因引人玉米，这是一种高效、无公害的控制杂草的手段. 在抗除草剂基因中, 来源于吸水链霉素(Str ep tomyces hygroscop icus) 的bar 基因被广泛用作玉米基因转化中的选择标记基因, 除草剂抗性基因的利用不仅可作选择标记, 同时使带有抗除草剂抗性的转基因玉米不受除草剂伤害而显著提高产量
9、, 节省大量人力。IMI 玉米是美国一家公司开发的抗除草剂玉米, 它对除草剂具有高度耐受性, 允许在植物上喷洒除草剂, 以控制一年生杂草和宽叶杂草, 该产品于1996 年已实现商品化。SR 玉米是BASF 公司开发的抗除草剂玉米, 对除草剂具有高度耐受性,在出芽后喷施, 可防治大多数禾本科杂草。2.3 抗病性转基因玉米抗病转基因玉米包括转抗细菌、真菌和病毒病基因3 类。其中转抗病毒病的研究初见报道。由于细菌和真菌病害存在多变的生理小种问题，目前研究较少。Grimsly 等20首次以玉米为材料，用胭脂碱型根癌农杆菌C58 将玉米条纹病毒的cDNA 导入玉米幼苗中，使植株表现出病毒感染的症状。杨利
10、国等利用花粉管通道法将广谱无毒抗病基因PYH157转入玉米自交系。张志燕开展了玉米转化2-5ARNase水稻黑条矮缩病毒原核表达的初步研究。Murry等21首次将玉米矮花叶病毒的外壳蛋白基因导入玉米，获得了抗MDMV 的转基因玉米。刘小红等22利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因MDMVCP 导入玉米优良自交系， 后代对玉米矮花叶病呈现不同程度的抗性。2.4 高品质育种玉米虽然高产但品质相对较差，蛋白质、赖氨酸含量较低， 其中赖氨酸含量只占种子干重的0.27%左右， 不论是作为粮食还是作为饲料， 都不能满足高品质的要求。为此各国科学家在玉米品质改良中做了大量卓有成效的工作。Torrent
11、等27将富含赖氨酸基因转入玉米改良醇溶蛋白；张秀君等将富含赖氨酸的马铃薯花粉特异水溶性蛋白的cDNA 转入玉米， 使种子干重中赖氨酸含量提高到10%以上。Sun 等29采用同样的方法使转基因玉米种子中赖氨酸含量提高了16%。丁明忠等利用花粉管通道法和减压渗透法将大豆总DNA 导入玉米自交系中，筛选出的高蛋白变异材料其蛋白质含量比受体高20%以上。2.5创造雄性不育植株利用基因工程创造雄性不育的研究工作已取得初步成效。Mariani 等31将来自烟草花药绒毡层特异启动子TA29 与核酸酶（Barnase） 基因融合后转化玉米，已成功获得雄性不育植株。刘大文等32利用玉米花粉特异启动子ZM13 启
12、动核酸酶（Barnase）基因在玉米花粉中表达，产生了部分不育植株。3 玉米转基因技术3.1 DNA直接转入技术不需依赖生物媒体，将特殊处理的裸露DNA直接导入玉米细胞，实现基因的转化。3.1.1 基因枪法基因枪法又称微弹轰击法( microproject ile bombardment) 其基本原理是: 将外援DNA 包被在微小的金粒或钨粒表面, 然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织, 微粒上的DNA进入细胞后, 整合到植物染色体上, 得到表达, 从而实现基因的转化。1989 年Klein 首次用基因枪法将GUS 和Pat 基因倒入玉米悬浮细胞系获得转基因玉米;Gordon-Koz
13、iel 等用基因枪法将构建的CryI A ( b)基因转入玉米幼胚, 培育出抗虫玉米, Vain 等将胚性细胞进行高渗透压处理, 显著提高了转化效率。1994 年赵天永、王国英、谢友菊用基因枪将GUS 基因导入玉米的茎尖组织; 1995 年王国英用基因枪法将防御素基因转入玉米并再生植株。原亚萍以玉米愈伤组织为受体, 用基因枪轰击将防御素基因装入玉米细胞, 经卡那霉索筛选及分化培养获得一再生植株。1999 年报道了中国农业科学院生物技术中心董云洲等用基因枪法转化花粉获得转基因谷子和玉米, 所用基因为GUS 。转玉米频率为0. 5% 0. 21% , 主要技术过程为收集花粉, 用JQ-700 型基
14、因枪将PBll21 质粒DNA 射入花粉, 经人工授粉得到大量的种子, 种子在加卡那霉素的培养液中萌发生长, 筛选到抗生苗, 经GU S 组织化学和分子杂交证明外援基因已整合与表达。随着对金属粒子的理化特性、DNA 与金属粒子的结合和靶组织特性、轰击前后的培养条件等深入研究和技术优化。基因枪法在玉米遗传转化中得到了广泛的应用, 已经成为玉米基因转化的主要方法之一。其优点是不用进行原生质体再生培养, 受体材料、靶细胞可以有广泛的来源, 如包括细胞悬浮培养物、愈伤组织、分生组织、未成熟胚等等; 不受基因型的限制, 可适用于不同的物种以及同一物种的不同品种。3.1.2 PEG法PEG是细胞融合剂，能
15、促进细胞膜间融合，利于外源DNA进入原生质体。PEG法建立较早，它随原生质体的发展而发展。这种方法成本低，结果比较稳定，存在的问题是建立可靠高效的原生质体再生系统比较困难。它和电激法结合使用会提高转化效率3.1.3 电击法用高压电脉冲作用对细胞“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的摄取。电激法可以用于原生质体，还可以用于胚性悬浮细胞系、愈伤组织和幼胚等。操作比较简单，但转化效率低。3.2 载体转化技术农杆菌是一种天然的植物基因转化系统，其含有的Ti或Ri质粒具有携带外源基因的功能。经过遗传工程的方法对农杆菌及质粒加以改造，并装入外源基因，借助农杆菌对植物的感染特性，将外源基因带入植
16、物细胞内。Ti 质粒的研究较详细而且应用广泛。T i 质粒根癌农杆菌在感染植物时, 能将其环状Ti 质粒上的一段DNA 插入至被感染植物基因组中, 并能稳定地遗传给后代, 但细菌本身不进入被感植物细胞, 由此发展出以农杆菌Ti 质粒为载体的植物遗传转化系统。该转化系统是目前研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。Grimsley 等通过农杆菌介导将玉米条纹病毒cDNA 导入玉米幼苗, 第一次证实农杆菌能够侵染玉米。Ishida 等报道用玉米幼胚与根癌农杆菌共培养获得了高效转基因植株, 共通过对菌株、菌液浓度、幼胚基因型等因素的优化, 使转化效率高达30% , 也成为玉米遗传转化的一个里程碑。目前已分离
