超滤管使用方法和注意事项

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1、超滤管使用方法和注意事项蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15 超滤管（MWCOlOkD）。也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视 目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用，使用一次就 扔掉太浪费。以下是个人总结的使用方法和注意事项。1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（ 10kD）。 到底选择多大截留分子量比较合适呢？ 10kDa、5kDa、还是30kDa?通常应截留 分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以 选择10kDa截留

2、分子量的超滤 管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截 留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐 受程度有所不同，表格中有。2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱 里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的 白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直 接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不同离心机的转速 rpm 换算成g之后，有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至最 低档，减小对

3、膜的压力。注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开 离 心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方 向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转 速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有 没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒 入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取 流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入 剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作， 防止蛋白受热），直

4、到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉 淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是 Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的 方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为 止。5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时 候，轻轻加入新的Buffer （经0.22um超滤膜超滤），再 浓缩至1 ml左右，连 续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul， 也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达 到1000倍以上，基本上可以

5、达到换buffer的目的。6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边 缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液， 每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度 太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过超滤膜，防止 膜失水变干。7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。8、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀， 可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬 起，然后倒 掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置2

6、0min，期间平 衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将 管芯浸入MilliQ水的烧 杯（1或2L）中,放置几个小时，再换新的水，放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。 50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用MilliQ水洗干净。9、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管 芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次 使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。实验室常用储存液的配置参数130%丙烯酰胺溶液【配制方法】将29g丙烯酰胺和lg N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60ml的水中。加

7、热至37C溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器 （0.45 口 m孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中保存 于室温。【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累 积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无 毒，但也 应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的 丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约 0.2体积的单床混合树脂（MBTMallinckrod t）,搅拌过夜，然后用What man 1 号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转

8、化成丙烯酰 和双丙烯酸。240%丙烯酰胺【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20gN,N-亚甲双丙烯酰 胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处 理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测 定。3放线菌素D溶液【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1： 10稀释贮存 液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D （分子量为1255）纯品在 水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm 处的吸光值为

9、0.182,放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于 -20C。【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风 橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或 皮肤。药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过 测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于 抑制自身引导作用。4. 0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至 7.0,用蒸馏水定容1ml,分装成小份保存于-70C5. 10mol/L乙酸酰溶液

10、【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。 6.10%过硫酸铵溶液【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4C 保存数周。7. BCIP溶液【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4C8.2XBES缓冲盐溶液【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BESN, N-双（2- 羟乙基）-2-氨基乙磺酸、1.6g NaCl和0.027g Na2HP04,室温下用HCl调节 该 溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml,用0.22 口

11、 m滤器过滤除菌， 分装成小份，保存于-20C。9. 1mol/L CaCl2 溶液【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl2?6H2O,用0.22u m滤器过 滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20C。【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml,用Nalgene滤器（045um孔径）过 滤除菌,然后骤冷至0 C。10. 2.5mol/L CaCl2 溶液【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解13.5g CaCl2?6H2O,用0.22 口 m滤器过 滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20C。11. 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT）溶液【配制方法】用20ml 0

12、.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,过 滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20C。【注意】DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。12. 脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液【配制方法】把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量 移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节 每一 dNTP溶液的pH值7.0 （用pH试 纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在给出的波长下读 取光密度计算出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的 dNTP，分装成小份贮存于-70C。13 0 5mol/l EDTA（pH8

13、0）溶液【配制方法】在800ml水中加入1861g二水乙二胺四乙酸二钠 （EDTA-Na?2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节 溶液的pH值至 8.0 （约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L,分装后高压灭菌备用。【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0,才能完全溶 解。14.溴化乙锭（10mg/ml溶液）【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完 全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。【注意】小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶 液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。15.2XHEPE

14、S缓冲盐溶液【配制方法】用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027g Na2P04?2H20、0.2g 葡聚糖和 1gHEPES,用 0.5mol/l NaOH 调节 pH 值至 7.05, 再用蒸馏水定容至100ml。用0.22 口 m滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于 -20C。16. IPTG 溶液【配制方法】IPTG为异丙基硫代-B-D-半乳糖苷（分子量为238.3）,在8ml 蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0. 22 口 m滤器过滤除菌，分 装成1ml小份贮存于-20C。17. 1mol/L乙酸镁溶液【配制方法】在800

15、ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤 除菌。18. lmol/L MgCl2 溶液【配制方法】在800ml水中溶解203.4g MgCl2?6H20，用水定容至1L,分装 成小份并高压灭菌备用。【注意】MgCl2极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长期 存放。19. B-巯基乙醇（BME）溶液【配制方法】一般得到的是14.4mol/L溶液，应装在棕色瓶中保存于4C。【注意】BME或含有BME的溶液不能高压处理。20. NBT溶液【配制方法】把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml 70%的二甲基甲酰胺中，保 存于4C。21. 酚/氯仿溶液【配制方法】把酚和氯仿等

16、体积混合后用0.1mol/L Tris?HCl（pH7.6）抽提几 次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/l Tris?HCl（pH7.6）液层，保存于 4C。【注意】酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿 防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的 水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。22. 10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml （10mmol/L），分装成小份贮 存于-20C。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤 吸收后有致命危险。