《[精品论文]DLL4 siRNA 对缺氧血管内皮祖细胞和脉络》由会员分享，可在线阅读，更多相关《[精品论文]DLL4 siRNA 对缺氧血管内皮祖细胞和脉络（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、精品论文DLL4 siRNA 对缺氧血管内皮祖细胞和脉络膜-视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和血管管 腔形成的影响5何花，李斌（华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科，武汉 430030） 摘要：【目的】 Delta 样配体 4 (DLL4)是 Notch 信号通路血管内皮特异性配体，在调节生理 及病理性血管形成中起重要作用。有研究表明 DLL4-Notch 信号通路受缺氧调节，可通过抑 制血管分支形成促进血管成熟抑制过度血管化。脉络膜新生血管(CNV) 是一种病理性新生10血管，已知缺氧在其形成中起着重要作用。本实验旨在研究 DLL4 在脉络膜新生血管形成中 的作用和机制。【方法】 用 200
2、mol/L CoCl2 造成体外细胞化学性缺氧，以探究 DLL4 对 缺氧条件下 CNV 形成过程中的主要参与细胞血管内皮祖细胞（EPC）和脉络膜-视网膜内 皮细胞 (RF/6A 细胞) 生物学功能的影响。DLL4 siRNA 转染细胞后, 利用 RT-PCR, real-time PCR 和蛋白印迹技术研究缺氧条件下 RF/6A 细胞中 DLL4 和其下游主要基因 HES1，HEY115的 mRNA 和蛋白表达变化。并进一步研究 DLL4 siRNA 对缺氧下 EPC 和 RF/6A 细胞参与新 生血管形成的生物学功能（包括细胞增殖，移行以及管腔形成）的影响。实验设立三组对照：分别为无转染的
3、空白对照、转染试剂对照及 Scrambled 阴性对照。【结果】缺氧导致体外 RF/6A 细胞中 DLL4 表达上调。转染 DLL4siRNA-duplex 1 后，DLL4 mRNA 的表达水平较 Scrambled 阴性对照组下降 91.4% ，其蛋白表达亦相应减少，而三个对照组间 DLL4 表达无20明显差异。 此外，缺氧条件下转染 siRNA-duplex 1 后，RF/6A 细胞中 DLL4-Notch 信号通 路下游的 HES1 和 HEY1 基因的 mRNA 表达较 Scrambled 阴性对照组分别下降 75.1% 和86.3%。进一步研究发现, DLL4 低表达可促进缺氧下
4、RF/6A 细胞增殖，导致进入细胞周期 S期。DLL4 siRNA 可促进缺氧下 EPC 和 RF/6A 细胞移行及血管管腔形成(P 0.05)。【结论】DLL4 是新生血管分支形成及血管出芽的负向调节因子。缺氧条件下 DLL4 信号途径在血管25内皮祖细胞和脉络膜血管内皮细胞的增殖、迁移和血管管腔形成中发挥着重要作用，DLL4 可能成为脉络膜新生血管疾病治疗的新靶点。 关键词：DLL4；siRNA；脉络膜新生血管；血管内皮祖细胞；脉络膜-视网膜内皮细胞；缺 氧；30Effect of DLL4 siRNA on proliferation,migration and tube formati
5、on of endothelial precursor cells and choroid-retinalendothelial cells under hypoxic conditionsHE Hua, LI Bin(Department of Ophthalmology,Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong35University of science and Technology, WuHan 430030)Abstract:【Objective】DLL4 (Delta-like 4) is an en
6、dothelium specific Notch ligand and has beenshown to function as a regulating factor during physiological and pathological angiogenesis. Choroidal neovascularization (CNV) is a pathological form of angiogenesis in which hypoxia is thought to play an important role. However, the role of DLL4 in the d
7、evelopment of CNV is still40poorly understood. 【Methods】 The study utilized chemical hypoxia induced by 200M CoCl2 toobserve the expression of DLL4 in endothelial precursor cells and choroid-retinal endothelial cells(RF/6A cells) which are the primary cells involved in CNV. After transfection of a D
8、LL4 siRNA, mRNA and protein expression of DLL4 and key downstream genes, including HES1 and HEY1, in hypoxic RF/6A cells were investigated by RT-PCR, real-time PCR, and Western blot analysis.基金项目：教育部新教师基金项目（基金编号 20090142120068）作者简介：何花，女，副教授，副主任医师，研究方向：眼脉络膜新生血管的基础研究. E-mail:- 1 -45The effects of the
9、DLL4 siRNA on the biological function of hypoxic endothelial precursor cells and RF/6A cells during angiogenesis, including cell proliferation, migration and, tube formation,were investigated. 【Results】 The results in vitro showed that hypoxic conditions lead toupregulation of DLL4 expression in RF/
10、6A cells. After transfection, siRNA-duplex1 targetingDLL4 depleted the DLL4 mRNA levels by as much as 91.4 compared with the scrambled50siRNA control, and DLL4 protein expression was similarly effected. In addition, after transfection of hypoxic RF/6A cells with the DLL4 siRNA-duplex1, the mRNA leve
11、ls of HES1 and HEY1,which function downstream of DLL4-Notch signaling, were lowered by 75.1 and 86.3,respectively, compared with the scrambled siRNA control. Furthermore, knockdown of DLL4 expression significantly promoted the proliferation of hypoxic RF/6A cells and led to their arrest55in the S ph
12、ase of the cell cycle. Migration and tube formation of hypoxic endothelial precursor cells and RF/6A cells were significantly induced by the DLL4 siRNA, compared with thescrambled siRNA (P 0.05). 【Conclusion】DLL4 functions as a negative regulator of angiogenicbranching and sprouting. Based on our re
13、sults, DLL4 signaling appears to play an essential role in the biological behavior of endothelial precursor cells and choroid vascular endothelial cells under60hypoxia. As such, DLL4 may represent a novel target for CNV therapy in the future.Keywords: DLL4; siRNA; choroidal neovascularization; endot
14、helial precursor cells; choroid- retinal endothelial cells; hypoxia0引言65血管新生是指在生理或病理条件下从已有的血管发展而形成新的血管，此过程包含了内 皮细胞和内皮祖细胞的增殖，移行以及血管管腔形成等重要环节。脉络膜新生血管合并年龄 相关黄斑变性是发达国家 60 岁以上人群视力不可逆性丧失的主要原因。其主要特征为脉络 膜新生血管通过 Bruch 膜侵及视网膜色素上皮或视网膜下1,2。脉络膜新生血管发病受多种因素控制，机制复杂。目前研究表明缺血缺氧在其形成过70程中起重要作用。而 HIF-1 和血管内皮生长因子 VEGF 是缺
15、氧条件下 CNV 的主要因子3-7。 过去的几十年里，CNV 治疗重点为抑制 VEGF 信号通路，但其疗效有限，很少有新生血管 永久退化，往往数月后新生血管重新生成8。这就提示临床抗新生血管治疗亟需新的靶点或 方法。Delta 样配体 4 是生理及病理血管过程中 Notch 信号通路的特异性配体。与 HIF-1 和75VEGF 相似，亦是缺氧调节基因。目前研究表明 DLL4-Notch 信号通路是新生血管出芽的重 要途径9-11。DLL4 的表达可抑制在血管生成中活跃的顶细胞，DLL4-Notch 信号通路通过抑 制血管分支形成，促进血管成熟来抑制新生血管过度形成12-17 。更有趣的是，在体阻滞 DLL4-Notch 信号通路可促进过度但无功能新生血管形成以达到阻止肿瘤生长的目的。因此， DLL4-Notch 信号通路提供了有别于目前治疗方案的血管靶向分子路径18,1980在 CNV 动物模型中, RBP-J-介导的 DLL4-Notch 信号通路在血管新生中起重要作用 20。尽管 DLL4 是肿瘤生长过程中调节血管新生的靶点，但是其对 CNV 抑制作用尚不清楚， 尤其是对脉络膜微血管内皮细胞的生物学功能知之甚少。为了解 CNV 形成中 DLL4 的表达及作用，我们体外用血管内皮祖细胞和猴脉络膜-视网 膜内皮细胞(RF/6A 细胞)来研究缺氧
