果蝇隐花色素全长结构隐花色素/光解酶家族（CRY/PL）调节所有生物对于紫外线和蓝光小剂量照射的 适应性反应而PLs在DNA修复环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）和光损伤的主要功 能是由紫外线辐射造成的，CRYs转换信号对于生长、发育、磁感知和生理时钟 很重要尽管有各种各样的功能， PLs/CRYs 保持了一个共同的结构折叠，依赖 于黄素腺嘌吟二核苷酸（FAD）和一个内部光活化机制然而，CRY/PL家族成 员在底物识别（蛋白质或DNA）、光化学反应催化和相关辅助因子方面存在区别 这在很大程度上是未知的，动物 CRYs 如何调节作用于它们底物的生物节律 CRYs 含有尾部添有保守的 PL 同源区域的多变的 C 端尾对于功能是很重要的 这里，我们报告一个 2.3-A 分辨率的有完整 C 端的果蝇 CRY 晶体结构类似于 凹槽的C端螺旋头结合DNA底物保守的Trp 536嵌入CRY催化中心模拟DNA 光损失的 PL 识别 FAD 阴离子半醌发现晶体按照便于重组的尾部螺旋呈现这 些结果有助于协调CRY/PL家族各种各样的功能，通过证明如何保存蛋白架构 光化学可以阐述一系列光驱动功能果蝇 CRY（dCRY）， I 型隐花色素，是一种飞行生物钟和磁感知的主要光 感受器。
II 型隐花色素也是哺乳动物是一种生理节律，但更主要的是参与光不依 赖转录抑制dCRY通常调节生理功能，通过在有光条件下无时间限制目标蛋白 （TIM）的泛素降解光也会导致dCRY降解，但需要更长的时间这个过程涉 及到的E3-泛素连接酶和行为相关光谱是相似的dCRY活跃光色素要么是被氧 化的FAD,要么是半醌状态的阴离子光可促进dCRY结合TIM；但是TIM降 解可能需要另一个光反应 dCRY 和 TIM 的光依赖性相互作用涉及 dCRY 的 C 末端dCRY有19或20个C末端残留在黑暗和光明的条件下都能结合TIM,但 是任然可以携带生物钟在低光下dCRY 2.3A分辨率的晶体结构是一个不寻常 的孪生非缺面对称结构（见补充方法和补充图1-4）不对称单元由一个dCRY二 聚体组成，但是接触的子单位并不很多（补充图 5） dCRY 与果蝇 6-4PL（6-4dPL） （图1a）非常类似，但是在环结构、辅助因子结合位点、FAD中央和大量可变 的 C 端延伸上显示了显著的差异额外的 23 个 C 端残基形成了一个短连接（残 基 516-529）从 PHD 延伸 10 个残基螺旋尾（残基 530-539）插入 6-4 光解酶活性 中心（图1）。
C端尾（CTT）PLs的微小DNA载体（6-4和CPD损伤）和Trp536 位置类似于6-4光损伤（图1、2）FAD位置被确定以便于改变可能影响大量dCRY 结合位点和 C 端残基 525-539 相互作用的电子状态，因此， FAD 光化学可以促 进 CTT 构象改变在细胞培养中， dCRY 在光条件下比黑暗条件下更不稳定， 并且在没有CTT（4）或CTT替代丙氨酸残基条件下也非常不稳定（A10；补 充图 6）丙氨酸替代 FFW 在小程度范围内降低 dCRY 的稳定性，在光照和黑暗 条件下，而W536A单独替代有较小影响（补充图6a）对于△和A10变体，这 个地方的 CTT-PHD 相互作用被破坏， TIM 使得 PHD 在光明与黑暗条件下同等 稳定（补充图6b）相比之下，FFW变体在黑暗条件下有一部分CTT功能，并 且在光条件下稳定TIM效应（补充图6b）TIM表明在光条件下PHD相互作用 可补偿黑暗条件的CTT因为只有野生型W536A变体显示增强黑暗破坏光稳定， TIM完全保证CTT相较于TIM更大程度稳定PHD （补充图6b）磷酸化也可以 调节 CTT 构象和 dCRY 稳定性大量光谱分析和晶体研究发现磷酸化位点在 Thr518，位于PHD和C端螺旋交界处（补充图7）。
CRYs和6-4PL之间的结构差别反映识别CTT而不是DNA底物并且是不同的规则 模型DCRY螺旋尾隔离PHD DNA结合槽是一个耦合位置针对于I型CRY的三个 环形区域（图1、2和补充图8）：（1）磷酸化结合环（残基249-263），调和磷酸化 阴离子靠近拟南芥PL6结构的FAD； （2）突出接口（残基288-306）,延长表面环毗 邻磷酸盐结合环；（3）c端盖（残基420-446），包裹dCRY C端螺旋（图2、3）相比6-4PL, dCRY磷酸化结合环已经被一个二次弯转延伸a8改变，代替了a8和a9交界 处的90度2扭结（图2和补充图8）dCRY a8扩展导致PL结构20A偏差，阻止磷酸 化结合环靠近FAD （图2）从赖氨酸244到腺苷N7去除一个氢键可使II型CRYs 稳定一个丝氨酸磷酸化保存位点虽然dCR 丫保存的这个磷酸化位点（丝氨酸 216）远离活性中心，但是在ii型CRYs可以使丝氨酸磷酸化稳定的残基在I型CRYs 并未找到（图2和补充图9）另外，在6-4dPL （赖氨酸154、赖氨酸161、赖 氨酸449、精氨酸502、精氨酸505）里几个确定的带电的结合DNA磷酸化主链 残基在dCR 丫中缺乏。
富含丝氨酸的C端盖是型CRYs的保守序列与结构，但是在I型CRYs和PLs 包含有一个不同的接口（图2）在dCRY， C端盖和154-160环之间的CTT结 合处链接器延伸到a/b域（补充图9）极为接近C端盖的CTT结合点，该区域可 能在目标识别中扮演一个角色，如TIM或JET. II型CRYs不同于型CRYs，在C端 盖6-4PLs引进了三个半胱氨酸残基（补充图9）dCR丫的结构预示富含半胱氨 酸的序列靠近II型CRYs活性位点，从而服务一个氧化还原相关功能（图2）ProtrusiondCRY6-4 PLDNA photDles-：oriwProtrusion motif / C-terminal tail helixFADTail helixTrp 422His 378Asn 382 丿 Trp 536:-314His 37S382Trp 536Trp 314LesionTrp 422Irp 422is 378Vai 300Asn 382Trp 3754伽49Arg532Vai 531 A—■ >cL 力图l|dCRY类似于6-4PLC端盖替代了DNA底物a,比较dCRY和6-4PL。
N端a/b 域（蓝色）耦合C端螺旋域（黄色）通过一个长链接（灰色）°dCRY的C端螺旋头 （红色）处的PL DNA结合裂缝除了黄素（黑色）b，C端螺旋识别槽特写C端螺旋（红色）色氨酸536插入毗邻FAD的6-4PL催化中心C, 6-4光裂解酶和dCRY 活性位点重合束缚嘧啶二聚体“dewar”损伤，结合在于FAD相关的相似位置组氨 酸378和色氨酸536.d，表面和C端螺旋（白色）^HD （黄色）黄素接口之间的化 学互补PLs用一个喋定衍生辅助因子，MTHF或8-HDF，作为蓝光接触敏感性FADH辅助 因子，从而促进电荷进入嘧啶二聚体dCRY被报道可以使少量MTHF纯化相反， 我们发现通过化工、光谱或结晶分析dCRY样品中的FAD没有额外的辅助因子纯化 昆虫细胞等温量热学也表明没有MTH F结合点，没有HD F类似物dCRY核黄素（补 充图10）此外，识别MTHF喋吟的残基在dCRY中比在大肠杆菌PL和拟南芥CRY中 有更多的不同特点（补充图11）相比于6-4dPL，dCRY保留了一个接头、环灵活 性和一些HDF相互作用的残基，但是其他的，特别是触须识别环（残基42-54）不 同于dCRY （图3d和补充图10）。
因此，dCRY不结合MTHF并且不太可能结合HDF， 除非一个独特的识别模型被使用值得注意的是，大多数CRYs呈现FADox或FAD- 状态，但不是DNA修复所需的FADH状态在缺失触须辅助因子的情况下很容易形 成FAD-（补充图12），这可能是很重要的基态，或CTT光调节的光化产品图2|I型CRYs详细结构图结合C端尾和dCRY活性中心耦联I型CRYs独特的三 环结构关键的图案，磷酸盐结合环合C端盖创建了一个CTT结合凹相比6-4PL （蓝色），一个b折叠改变了dCRY （黄色），取而代之的是YLP图形，来自于6-4PL 赖氨酸腺苷酸相互作用20纳米分辨率在一个开放构象中一个六肽残基插入磷酸 环C端结合槽dCRY有一个二次弯转延伸a8螺旋领导凸出图形C端链接器使一个 插入富含丝氨酸的环保持密切联系：C端盖（残基424-432）CPDPLdCRYLe
dCRY和6-4PL环区域附近辅助因子有不同的结构 和 成分（例如，6-4PL，异亮氨酸50-dCRY谷氨酸45，亮氨酸51-丝氨酸46,亮氨 酸40-脯氨酸42，甲硫氨酸54-甘氨酸50）C，dCRY黄素中心（黄色）和6-4PL 比较（橘黄色）dCRY半胱氨酸416替代6-4PL天冬氨酸403，并且是氢键结合距 离N5和FAD的04都较远环与核糖之间的链接被半醌改变（黑箭）在曝光下dCRY很快转化成一种阴离子半醌FAD -，然后衰变回到依赖氧的FAD 氧化态相反，PLs通常形成中性半醌（FADH）在PLs，—个天冬氨酸残基使用 质子化了的黄素N5准备氢键,但是没有未质子化黄素的相互作用（图3c）在dCRY， 相同位置的半胱氨酸416在远距离的质子化的N5和O4之间的氢键（图3c）因此, 位于F AD-O4和N5的负电荷通过中性疏基使其稳定这些相互作用可以组织进一步 的质子向FAD-转移，从而不支持减少两个电子的状态转换（FADH-）FADox光还 原成FAD-依赖于逐步的电子转换，从CRY/PL保存的色氨酸三元组（色氨酸324- 色氨酸397-色氨酸420-FAD）I型CRY在昆虫细胞重组表达，色氨酸三元组需要 光还原反应从FADox到FAD-，而不是光诱导退化。
然而，不同于其他的CRY/PL， CTT的色氨酸536提供和色氨酸420一样的接近黄素环的吲哚（图4a）因此，色 氨酸536光氧化作用在视网膜蛋白质中发挥作用dCRY黄素显示失真说明（图3c）， 黄素蛋白晶体暴露在高剂量X射线下°Sp3增幅的下降导致蝴蝶黄素和异咯嗪与和 糖醇侧链之间延伸角度的扩大FAD-可能形成晶体因为低电位还原剂不能减少 dCRY超越FAD-，并且没有进一步光还原反应，即使在皮秒的时间尺度上重要的 是，减少黄素构象影响临近残基直接接触的尾巴螺旋（图3c ）dCRY也保存一个 PLs与色氨酸536接触的活跃位点组氨酸残基（图3c、4b）在PL，组氨酸378类 似物使黄素半醌状态质子化；在dCRY 一个相似的过程将进一步研究CTT和活性中 心的相互作用虽然结构中的晶体包装阻止CTT分离，两个结晶的独特dCRY分子 显示了螺旋尾模式的变化，这包含埋在囊中只有一个分子的门冬氨酸539的位移（图4b）这些构象表明，当黄素减少时CTT并没有被紧紧束缚最近一项研究 表明，dCRY的光激发FAD-态暴露了两个胰蛋白酶位点在Dcryd C端：一个在PHD 域的底部，另一个在CTT内部。
FAD的实质性结构变化在减少，这多少有点令人'惊 。