好氧颗粒污泥EPS动态变化解析1引言好氧颗粒污泥相比传统的絮体污泥，具有规则而紧密的微生物结构、高污泥浓度、杰出 的沉降性能和耐冲击负荷等许多优越的性能，因此，近年来备受关注影响颗粒污泥形成的 因素很多，其中，研究者们较一致地认为颗粒污泥的形成与胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)的产生有关.胞外聚合物是微生物在一定环境条件下分泌于胞 外的复杂非均相高分子聚合物，是菌胶团、颗粒污泥和生物膜的重要组分，是维持污泥三维 空间的重要骨架.目前，人们对好氧颗粒污泥中EPS的成分、提取方法、性能、影响因素等 方面均进行了相关的研究，但好氧颗粒污泥形成过程中EPS的变化和作用机制仍然有待进一 步明晰.因此，本研究通过建立一个SBR污水处理系统，分别进行普通活性污泥和好氧颗粒 污泥培育，探索污泥颗粒化过程中EPS的动态变化、组分及在污泥中的空间分布.2试验方法与材料2.1原水配制与接种污泥反应器试验用水采用人工配制污水，主要成分有CH3COONa、NH4Cl、KH2PO4、FeSO4、 MgSO4、CaCl2 和微量元素.进水 COD 为 600~800 mg - L-1，氨氮为 50~60 mg - L-1，总 磷为9 mg - L-1左右.试验接种的污泥来源于浙江省杭州市一座城镇污水处理厂二沉池2.2试验装置及运行方式反应器高100 cm，直径10 cm，有效容积为4 L，由顶部进水，每周期出水2 L，系统 采用时间控制器进行控制，周期均为4 h.本试验根据不同运行工况可分为3个阶段：第1 阶段(0~28 d)，进水10 min，曝气3 h，沉淀40 min，出水和闲置10 min;第2阶段(28~46 d)，沉淀时间由40 min缩短为10 min;第3阶段(46~72 d)，沉淀时间由10 min缩短为3 min. 培养温度为室温.分别在第24、33和72 d对反应器中混合液进行EPS提取和检测.2.3 EPS的分析方法本研究将总EPS按照组分与细菌分离难易程度及其空间分布分为3类：溶解性EPS、松 散结合型EPS和紧密结合型EPS.其中，溶解性EPS是指与细胞薄弱连接或溶解在污泥所处 系统中由细胞分泌或自溶产生的高分子聚合物;松散结合型EPS是指位于结合型EPS外沿， 没有明显边界、松散分散分布的黏性层;紧密结合型EPS是指位于结合型EPS内部，与细胞 表面紧密稳定结合的具有特定形状的黏性层.同时采用EPS中的两大组分蛋白质和多糖之和 来表征总EPS.污泥预处理和EPS提取采用加热离心法.取泥，泥量为烘干后120~200 mg(如4000 mg • L-1可取40 mL);将样品在4000 r • min-1下离心15 min，取上清液检测溶解性 EPS(Soluble EPS，S-EPS);之后再将样品在 4 °C、10000 r - min-1(Sigma 3218K 型高速 离心机)下离心15 min，取上清液检测松散结合型EPS(Loosely-bound EPS，LB-EPS);重新 悬浮在去离子水中，重复上述离心操作，然后将其置于玻璃匀浆器内4 C下匀浆5 min，使 样品均一化(匀浆的目的是让聚合物充分暴露，若为颗粒污泥需要捣碎才能尽可能多的提取 EPS),加入蒸馏水稀释到40 mL，搅匀，放入80 °C水浴锅加热60 min,将样品在4 °C、12000 r - min-1下离心30 min，得上清液检测紧密结合型EPS(Tightly-bound EPS, TB-EPS); 过0.22 p m的滤膜，取样5 mL左右，同时取100 mL混合液测定VSS，最终采用单位质量 污泥所产生的EPS来表征反应器系统中的EPS浓度.蛋白质的测定采用改良型BCA蛋白质测定测试盒(上海生工：Modified BCA Assay Kit， 多糖的测定采用蒽酮硫酸法.EPS分布的分析采用激光共聚焦扫描电子显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM).将从反应器中取出的样品放置于液体的冷冻介质(Frozen Section Medium Neg-50， Richard Allan Scientific)中大约 15~20 min，等待冷冻介质完全渗入样 品后，将其置于冷冻切片上快速冷冻.样品污泥可以从赤道横截面方向被切成不同厚度的薄 片，也可完整地使用.本试验使用被荧光染料Alxea-488(Molecular Probes，Eugene，Oregon， USA)标记的稀释比例为1 : 10的金橙黄色孢盘菌凝集素荧光染色剂AAL-488(Vector， Bulingame，California，USA)对样品污泥中EPS成分进行染色，该染色剂荧光的发射波长 为488 nm.对于样品污泥中的细菌成分，本试验选用稀释比例为1： 1000的核酸染料Syto 60(Molecular Probes， Eugene， Oregon， USA).被该染料染色后的细菌会发射出波长为633 nm的荧光.将染色后的样品放置于一台正置式型号为TCS SP的共聚焦扫描电子显微镜下进 行观察.EPS和细菌被染色后的荧光经过激发后分别在505~545 nm和大于650 nm的波长范 围内被捕捉和记录.观察使用的水镜光圈为20X0.8 NA，扫描方向为XYZ方式，扫描图像储 存为512X512像素图片.2.4其它参数的分析方法COD、氨氮、MLVSS、MLSS、SVI依照国家环保局《水和废水监测分析方法》(第4版)进 行测定;污泥外观形态变化采用Motic公司的DMWB1-223PL型光学显微镜进行观察，颗粒污 泥强度的测定采用的测定方法.3结果3.1污泥外观形态变化利用光学显微镜对接种污泥和反应器内的污泥外观形态进行观测和拍照取运行24、33 和72 d的污泥分别代表普通活性污泥期(简称“普通污泥”)、颗粒污泥形成初期(简称“颗 粒初期”)和颗粒污泥形成稳定期(简称“颗粒稳定”)3个阶段.其中，普通污泥期是指污泥 以絮体形式存在，絮体的大小和形态由接种期开始的明显变化直至相对稳定，且不具有颗粒 化趋势的时期;颗粒污泥初期是指小颗粒初步形成且有不断增大的趋势，但其周围仍旧存在 较多絮体的时期;颗粒污泥稳定期是指相较颗粒污泥形成初期，污泥颗粒明显增大、规则致 密，且颗粒的大小和形态相对稳定的时期.接种污泥和3个运行工况下典型污泥的外观形态 变化如图1所示.可以看出，接种的城镇污水处理厂污泥主要是以细小絮体为主的普通活性 污泥;SBR中运行24 d的污泥出现了一些大的并质轻的菌胶团，但大部分为絮体污泥;运行 28 d后，减少了沉淀时间，轻质絮体污泥容易被洗出，颗粒污泥逐渐形成，第33 d的污泥 已基本颗粒化，平均颗粒粒径为200 p m;46d后继续减少沉淀时间，颗粒形成更趋于稳定，第72 d的颗粒污泥相对致密，平均粒径达到335以m,颗粒污泥的机械强度(以完整性系数 计)为98.98%，与之前相关研究中的数据相近.图1 SBR运行过程中污泥的外观形态变化(a.接种污泥;b.普通污泥，第24天;c.颗粒初期，第33天;d.颗粒稳定，第72天)3.2污泥浓度和沉降性能变化反应器中混合液污泥浓度(MLSS)和污泥容积指数(SVI)的变化如图2所示.随着反应器 的运行，MLSS逐渐增加.在前期普通活性污泥法运行阶段，MLSS缓慢增加至6.4 g - L-1左右.沉淀时间减少至10 min时，MLSS呈现快速上升趋势;沉淀时间继续降低至3 min，师 选出沉降速度慢、沉降性能差等不利于出水水质的絮体污泥，此时MLSS有所降低，而后又 缓慢上升直至最后基本稳定在10 g - L-1左右.原接种污泥沉降性能差，SVI为123.2 mL • g-1，之后SVI的曲线一直呈现下降趋势，直至第28 d，即沉降时间为10 min后， SVI迅速下降并渐渐稳定在50 mL • g-1附近，进一步将沉降时间缩短后，SVI随运行时间 的延长而继续降低至40 mL • g-1附近.随着好氧污泥颗粒化的进程，MLSS逐渐升高，SVI 逐渐降低，说明了污泥浓度和沉降性能的提高.沉淀40 min 沉淀10 min 沉淀3 mm16()140120100 —I■2 -1 -0 —JL_ 1—“1__L. “」_」一」__IL .」__I.一.L _」一 ___L0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 726。
斜40200污泥培养时间/d图2好氧污泥颗粒化培养中MLSS和SVI的变化3.3颗粒化前后污染物去除对比颗粒化前后SBR典型周期中氨氮和COD的变化如图3所示.由图3可知，颗粒化前后氨 氮去除率均接近100% .随着氨氮快速降低直至为零，亚硝氮先增加后减少，硝氮逐渐增加， 总氮基本呈现先快速下降后缓慢上升的趋势.颗粒化前后COD均呈现先快速下降后略有上升 再逐渐下降的趋势，普通活性污泥的COD去除率为94.05%，好氧颗粒污泥的COD去除率为 97.07%.可以看出，普通活性污泥和颗粒污泥在氨氮和有机物的去除方面几乎没有区别图3普通污泥和颗粒污泥典型周期中氨氮、亚硝氮、硝氮、总氮和COD的变化3.4不同类型EPS的变化颗粒化过程中总EPS、溶解性EPS、松散结合型EPS和紧密结合型EPS含量的变化如图4 所示.曝气末普通污泥、颗粒初期和颗粒稳定期污泥中总EPS含量分别为162.96、226.83 和231.15 mg - g-1（以VSS计，下同），这说明颗粒污泥总EPS均比普通污泥高.目前存在 的胞外聚合物假说认为，胞外聚合物EPS能通过架桥等作用连接和粘附细胞，从而形成颗粒 污泥.结合试验结果表明，EPS在污泥的絮凝性和颗粒结构的稳定性方面都具有重要意义溶 解性EPS在普通污泥中数量极少，在颗粒初期污泥中为67.90 mg - g-1，占总EPS的31.48%， 颗粒稳定污泥中为35.32 mg - g-1，占总EPS的22.60%，这表明颗粒污泥中溶解性EPS 都高于普通污泥，且颗粒形成初期增长明显.观察图4可以得出颗粒化过程中存在松散结合 型EPS，但相比总EPS，松散结合型EPS含量较低且变化幅度不大.曝气初期，颗粒污泥中松 散结合型EPS均高于普通污泥，随着曝气时间的延长，有下降的趋势，在此过程中，松散结 合型EPS是否被细菌利用、降解或转化成其他物质还有待更进一步的研究此外，曝气末普 通污泥中紧密结合型EPS为161.06 mg - g-1，占总EPS的98.83%.颗粒初期污泥中含有 155.42 mg - g-1，占总EPS的68.52%，颗粒稳定期污泥中为178.92 mg - g-1，占总EPS 的77.40%.不难看出，3类污泥中EPS含量均以紧密结合型EPS为主要成分.对比曝气起点和 终点紧密结合型EPS变化的幅度发现，普通污泥差值为50.27 mg - g-1，颗粒初期差值缩 小为15.84 mg • g-1，颗粒稳定期进一步缩小为6.12 mg • g-1，这说明紧密结合型EPS 含量在颗粒污泥系统中相对稳定，而普通污泥系统中的EPS受沉淀和厌氧期的影响较大，这 可能是普通污泥没有颗粒污泥更为密实结构的原因.250柱I:普通污泥 匚二i溶解性20015010050柱2:颗粒初期 柱3:颗粒稳定■松散结合型匚紧密结合型30 60曝气时间/min图4颗粒化过程中总EPS、溶解性EPS、松散结合型EPS和紧密结合型EPS含量的变化3.5 EPS中蛋白质和多糖的变化颗粒化过程中蛋白质和多糖含量的变化如图5所示.普通污泥和颗粒污泥中蛋白质含 量均高于多糖，是污。