设计跨内含子引物的方法

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1、设计跨内含子引物的方法一、为什么要设计跨内含子的引物 区别或消除gDNA的扩增5典祁eDMAfiKOA 1Enji 31Enon 2Lx DM 3cDNA$irj)il jmpioofTW.bhioo.cQH二、如何设计1、在pubmed上找到目标基因的DNA序列以及其内含子和外显子情况 步骤：打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称，找到符合要求的基因，links到geneback 即可显示出该基因DNA的信息，这是基因组DNA，从mRNA选项中JION后面的是外显子 的位置，为了以后的操作，可以把这个DNA序列、外显子和CDS序列的起至位置记下 来。2、在pubmed上找到目标基因的m

2、RNA序列 步骤：打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称，找到符合要求的基因，点击进入基因页面， 即可显示出这个基因的mRNA信息，最后的ORIGIN是CDNA序列，把它记下来。注：最好能找到以NM或XM开头的序列，以此做为设计引物的模板。NCBI RefSeq （美国国立生物技术信息中心参考序列库）是目前世界上最完整和最具有权威性 的人类基因组编码mRNA序列数据库。它已收集了大约17,500个经cDNA测序证实的NM 序列，还有大约10,000个主要由计算机推测产生的XM序列。由于一些序列来自异常连接 产生的转录物或由计算机推演产生的不正确内含子-外显子剪切，因此该数据库所收集的参

3、考序列一直在不断地被修改中，尽管如此，NCBI RefSeq仍是目前最可信赖的人类基因mRNA 序列数据库。3、如何设计跨内含子的引物（利用primer 5）步骤:1）、在第2步页面右边,Analyze this sequenceRun BL7STPick Primersreal time PCR 一般产物长度为80150bp，引物长度1520bp，点击GET primer。2）、会得到若干条引物，从图中信息即可看出跨内含子的引物，建议只用BLST找到跨 内含子的引物在CDNA的定位，然后，用primer 5继续设计引物。此时，需记下跨内含子引 物所在2个外显子的位置（确认是否在CDS序列内）

4、。3）、打开 Primer Premier5，点击 File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy 步 骤 1 的 CDNA 序列在输入框内（选择 As ）， 此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白 。点击 Primer，进入引物窗口。4）、此窗口可以链接到“引物搜索” “引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search 按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers” 一一 “Pairs”，设定搜索区域、引物长度和产 物长度。搜索区域即为上一步记下的两外显子序列位置，QPCR引物长度大约为1520bp，产 物长度为80150bp.在Search Parameters里

5、面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参 数选择默认即可。5）、点击OK,软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结 果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示 出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。6）、对于引物的序列,可以简单查看一下，Tm应该在5570度之间,GC%应该在45% 55%间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的 最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引 发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，

6、点击该红色按钮，即可看到相应二级结 构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None” 为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配 的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的 评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感 觉不如 Primer5.7）、在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物， 然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，

7、里 面有该引物的详细信息。4、用PRIMER 5查找已知引物的在DNA序列内的产物位置，确定其是否跨内含子 步骤：打开PRIMER 5,将DNA序列贴入，点击primer，显示primer primer界面，点击左上 方的“S”，再点击EDIT primer，显示EDIT primer界面，在“5 -3 ”框中贴入上一 步确定的Forward primer，点击as is，显示序列已被贴入，点击analyze，再点击primer， 显示输入的序列和已知DNA良好配对，点击OK。显示“primer primer界面” 点击 左上方的“A”，再点击EDIT primer，显示EDIT primer

8、界面，在“3 -5 ”框中贴入 已知的REVERSE primer，点击REVERSE，显示序列已被贴入，点击analyze，再点击 primer-，显示输入的序列和已知DNA良好配对，点击0K,显示“primer primer界面” 在右上角显示PCR产物的起始和结束位点。对照步骤1记录的CDS起始位点，即可 验证。5、用Oligo验证评估引物1）、在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open,定位到目的cDNA序列（在primer中， 该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability （Delta G）窗 口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最

9、左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的 上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击ChangeCurrent oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引 物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各 种强大的引物分析功能了。2）、Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息， 其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引

10、 物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G.3端的Delta G过高，会在错配位点形成 双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。3）、Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引 物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower， 即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响 PCR 反应异常的重要因素，因此 应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其 Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mo

11、l,结合碱基对不要超过3个。Oligo此项 的分析窗口中分别给出了 3端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。4）、Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物， 同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。5）、Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基 的组成比例和Tm值。上下游引物的GC%需要控制在40%60%，而且上下游引物之间的 GC%不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor meth

12、od、%GC method 和 2（A+T）+4（G + C）method,最后一种应该是 Primer5 所采用的方法， Tm 值可以控制在5070度之间。6）、第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分 析，但不如oligo详细，并且oligo会给出正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误 引发效率在 100 以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400500，错 误引发效率超过 100 幅度若不大的话，也可以接受。7）、其次Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中

13、间高、两边低的弧形， 最起码保证 3 端不要过于稳定。8）、Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反 应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。 若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价 中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。9）、引物评价完毕后，可以选择File-Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有 Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和 Delta G窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR 窗口。10）、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些 其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要 没有交叉的其他基因的同源序列就可以。