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1、第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1. 免疫细胞的分离2. 淋巴细胞表面标志的检测3淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1原理：外周血中单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同， 介于1.0751.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.0301.035之间。因而可利用一种 比重介于1.0751.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布 而加以分离。2. 试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种(1) Ficoll分层液法：主要用于分离外周
2、血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布 由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层o Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺， 是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特 点。操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻 铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。血 小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。其分布由上到下依次为：稀释的血浆
3、层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。见下图。 图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷(2) Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含 单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷a歆何巴如鮒电介 j倔粘眼|胞曲二、淋巴细胞的分离1纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37C和Ca2存在时，能主动粘附
4、在玻璃、塑料、尼龙毛、棉 花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。主要的方法有： 粘附贴壁法；吸附柱过滤法；磁铁吸引法。2. 淋巴细胞亚群的分离原则：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。根据细胞的特性和 标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法，而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞为阴性选择。 常用的方法包括：E花环沉降法；尼龙毛柱分离法；亲和板结合分离法；磁性微球分离法及荧光激 活细胞分离仪分离法。三、淋巴细胞的保存与活力测定1淋巴细胞的保存技术(1) 短期保存技术：将分离的细胞用适量含10%20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、R
5、PMI1640或其 他培养液稀释重悬。短期保存可置于4C保存。(2) 长期保存技术：液氮深低温(-196C )环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。2活力测定：最简便常用的为台盼蓝染色法。台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能 透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜 进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。第二节 淋巴细胞表面标志的检测一、T细胞表面标志的检测1特异性抗原检测：用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类：一类是用标记抗体染色，如 免疫荧光法、酶免疫法、ABC法及免疫金银染色法；
6、另一类用抗体致敏的红细胞作花环试验。2特异性受体的检测原理：T细胞表面有特异性绵羊红细胞（E）受体，当人的T细胞与绵羊红细胞悬 液按一定比例混合后，置4C至少2小时或过夜，T细胞表面的E受体可与绵羊红细胞结合形成玫瑰花样的 花环，称为活性E （Ea）花环。检测Ea花环形成细胞可反映受检者的细胞免疫水平。3. T细胞亚群检测：见第二十二章流式细胞仪分析技术。二、B细胞表面标志的检测B细胞具有多种特异性抗原和受体，据此建立了相应的检测方法，一般用以研究B细胞各分化发育阶段 的特性，也可藉以鉴定和计数各阶段B细胞在人外周血和淋巴样组织的分布以及疾病时的变化动态，为临 床提供诊治相关疾病的有用信息。1
7、. B细胞表面抗原的检测：B细胞表面有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，其中有些系全 部B细胞所共有，而有些仅活化B细胞所特有，据此可用相应的CD系列单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、 酶免疫组化或ABC法加以检测。2.SmIg的检测：大多采用间接荧光免疫法或包括ABC法在内的酶免疫组化法，关键是选用高效价、高 特异性和高亲和力的荧光或酶标记的多价抗人Ig抗体，也可分别用各种类型的Ig,即IgM、IgG、IgA、IgE 等抗血清，检测带有各种类型Ig的B细胞，在人外周血中以带有SmIgM的细胞数为最多。B细胞经荧光标 记的抗Ig抗体染色，细胞膜表面呈现的荧光着色可有不同
8、的形式，开始均匀分布呈环状，其后集中在某些 部位呈斑点状，然后又可集在一个部位呈帽状，最后可被吞饮入胞浆直至荧光消失。这一现象是由于淋巴 细胞膜由双层类脂组成，上嵌有蛋白分子，在体温条件下，膜呈半液体状，而镶嵌物能在其中移动。当SmIg 抗体发生结合时，由于抗血清为双价，使SmIg出现交联现象，这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状， 时间过长，帽状结合物可脱落或被吞饮而消失，因此染色后，观察时间不能超过30min，或在染色时加叠氮 钠防止帽状物形成或被吞饮。三、自然杀伤细胞（NK）及功能的检测NK细胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CD16、CD56和CD69等多种抗原，但均非NK
9、细胞所特有， 因此极少以CD系列抗原为指标鉴定和计数NK细胞，现多检测NK细胞活性，因NK细胞具有细胞介导的细 胞毒作用，它能直接杀伤靶细胞。测定人NK细胞活性多以K562细胞株作为靶细胞，而测小鼠NK细胞活性 则用 YAC 细胞株，检测方法多种多样。1形态法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合温育，继用台盼蓝或伊红Y等活细胞拒染的染料处理， 然后分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，推算NK细胞活性。2. 酶释放法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合温育，离心沉淀，取上清液检测靶细胞遭破坏后释 放出的酶含量。3. 荧光法：用荧光素标记靶细胞，经与效应细胞共温后，离心去上清，用荧光计检测剩余的活靶
10、细胞 的荧光。4. 核素法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合共温后，离心检测上清液或剩余靶细胞放射性的量， 间接反映其活性。方法有靶细胞胞浆释放法和胞核释放法两种。5化学发光法：当效应细胞与靶细胞接触时，效应细胞呼吸暴发，生成极不稳定的02-及0H-,放出光子， 在发光剂存在条件下，可被光电倍增管接受和计数，发光量与NK细胞杀伤能力相关。第三节 淋巴细胞功能检测技术一、T细胞功能的检测1. T细胞增殖试验：又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继发生变 化，在2448h内细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆扩大、 出现空泡、核仁明显、
11、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又称为 淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。（1）非抗原性刺激物：如植物血凝素（PHA）、刀豆素A （ConA）、美洲商陆（PWM）、脂多糖（LPS）, 通称促有丝分裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B类细胞，PHA和ConA刺激T细胞增殖（2）抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型 组织抗原等。2. T 细胞增殖试验类型（1）形态法：其原则是将外周血液或分离的单个细胞与适量的植物血凝素（PHA）混合，置37C培养 72h,取培养细胞作涂片染色镜
12、检。据细胞的大小、核与胞浆的比例、胞浆的染色性和核结构以及有无核仁 等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡性母细胞和核有丝分裂相以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细 胞，每份标本计数200 个细胞，计算转化率。（2）核素法：绝大多数外周血T细胞通常处于细胞周期的G0期，受特异性抗原或促有丝分裂原激活后， 从G0期进入期，开始合成蛋白质、RNA和DNA前体物质等，为DNA复制准备物质基础，然后进入S期， 细胞合成DNA量倍增，此时若在培养液中加入3H标记的TdR，后者掺入新合成的DNA中，据掺入的多少推 测细胞增殖程度。3. T细胞介导的细胞毒试验：T细胞介导的细胞毒试验是细胞毒性T细胞的特性，凡致
13、敏T细胞再次遇 相应靶细胞抗原，可表现出破坏和溶解靶细胞，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。该试验原则 是选用适当的靶细胞（常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株），经培养后 制成一定浓度的细胞悬液，按一定比例与待检的淋巴细胞混合，共温育一定时间，观察肿瘤细胞杀伤的情 况。二、B细胞功能的检测1. B细胞早期活性指标的测定：B细胞经不同抗原激发即开始分化增殖，初期表现为体积增大，可用仪 器加以检测。激活的B细胞表面MHCII类抗原的表达增多，可用相应的单克隆抗体通过荧光免疫或ABC法检 测。2. 溶血空斑形成试验：经典的溶血斑试验用于检测实验动物抗体形成细胞的功能，
14、其原理是将绵羊红 细胞（SRBC）免疫小鼠，4天后取出脾细胞，加入SRBC及补体，混合在温热的琼脂溶液中，浇在平皿内或 玻片上，使成一蒲层，置37C温育。由于脾细胞内的抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC 致敏，在补体参与下导致SRBC溶血，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（plaque）。每 一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。这种直接法所测的细胞为 IgM生成细胞，其他类型Ig由于溶血效应较低，不能直接检测，可用间接检测法，即在小鼠脾细胞和SRBC 混合时，再加抗鼠Ig抗体（如兔抗鼠Ig），使抗体生成细胞所产生的IgG或IgA
15、与抗Ig抗体结合成复合 物，此时能活化补体导致溶血，称间接空斑试验。但是上述直接和间接空斑形成试验都只能检测抗红细胞 抗体的产生细胞，而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生情况。如果用一定方法将SRBC用其它抗原 包被，则可检查与该抗原相应的抗体产生细胞，这种非红细胞抗体溶血空斑试验称为空斑形成试验，它的 应用范围较大。现在常用的为SPA-SRBC溶血空斑试验。SBA能与人及多数哺乳动物IgG的Fc段呈非特异性结合，利用 这一特征，首先将SPA包被SRBC，然后进行溶血空斑测定，可提高敏感度和应用范围。在该测试系统中， 加入抗人Ig抗体，可与受检细胞产生的免疫球蛋白结合形成复合物，复合物上的
16、Fc段可与连接在SRBC 上 的SPA结合，同时激活补体，使SRBC溶解形成空斑。此法可用于检测人类外周血中的IgG产生细胞，与抗 体的特异性无关。用抗IgA、IgG或IgM抗体包被SRBC,可测定相应免疫球蛋白的产生细胞，这种试验称为 反相空斑形成试验。3. B细胞增殖能力的试验（1）不同刺激物诱发增殖试验：抗IgM抗体和细菌脂多糖均能刺激B细胞增殖，培养13天以后，加3i-tdr，与淋巴细胞增殖试验一 样，检测细胞内cpm，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数。也可用台盼蓝法计细胞增殖或用DNA特异 性染色观察胞内DNA或RNA的分化程度。（2）葡萄球菌诱导试验：葡萄球菌coweni株（SAC）表面富含SPA。该试验不依赖T细胞的参与，操作原则是将SAC与淋巴细胞 按一定
