大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法（Jin Quan-Wen Lab at XMU）一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：第一天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5ml LB液体培养基的培养管中， 可以准备两管220rpm，培养过夜（14-16个小时）2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收 集细菌用3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细 胞用第二天：1. 取2-5ml过夜培养液，接入500ml LB （或2XTY）液体培养基中，控制起始 OD600= 0,03-0,0537°C, 220rpm，振摇2-4 小时，每半小时测一次OD,当 OD值达到0.4时，停止培养2. 将菌液在冰上预冷30分钟同时，开启离心机，预冷至40Co3. 随后将菌液分装到250ml或500ml预冷的离心瓶中，44000rpm离心15 分钟4. 弃上清液，先用少量（如20-50ml ）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加 水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）4000rpm 离心 15 分钟。
5. 弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水 中4000rpm，离心 15 分钟6. 弃上清，往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加10% 甘油至终体积约为20ml 4000rpm,离心10min7. 小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入2ml 10%甘油（灭菌，预冷）重悬 浮细胞8. 将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中，在液氮中快速冷冻后， 于-70冰箱中保存9. 检测转化效率：取100皿新鲜制备的感受态细胞，加入0.01ng已知浓度的 plasmid DNA，电转化后，将重悬在1ml SO培养液并复苏的细胞分别取10皿 （1%）和100 ^l （10%）涂板，估测转化效率 Optimal efficiency is ca. 1X108 cfu/pg DNA for general cloning.** For library transformation, efficiency with ca. 1X109 cfu/pg DNA is required.感受态细胞制备简要流程：收集细胞9冰水冲洗细胞2次910%甘油冲洗细胞1次分重悬细胞在10%甘油分分装二、电转化［连接产物、纯化质粒或质粒文库］:1. 从-80OC冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。
2. 将无菌的电击杯置于冰上预冷3. 将解冻的感受态细胞按照40〜100ul/管转移至预冷的1.5m l的离心管中，小 心混匀，冰上放置4. 取1-2 pl纯化的质粒或克隆连接产物于1.5ml的离心管中，冰上放置10min ［加入的DNA体积过大时，其中的盐会造成电击时产生电火花！］5. 打开电转仪［Bio-Rad Gene Pulser System］,调至Manual,调节参数设置为25 pF, 200 OHMs,电压为2.0 kV ［这些参数设置可以根据经验略作调整］6. 将此混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电 极杯的底部用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水7. 将电击杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速 加入2X 500rl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中8. 37OC, 220 - 250rpm 复苏 1 小时9. 离心，涂板，置于37OC，过夜培养，次日查看转化结果三、电击杯的清洗和保存：1. 用清水将用过的电击杯稍微冲一下，向电击杯中加入75%酒精冲洗2. 弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2〜3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电 击杯10次以上。
3. 加入无水乙醇1-2ml于电击杯中，浸泡5分钟4. 弃去无水乙醇，将电击杯倒置于吸水纸上让乙醇充分挥发5. 将清洗并干燥好的电击杯加上盖子，存放备用几种可以选用的细菌培养基:200ml500ml1000mlLB1 g yeast extract2 g tryptone (or peptone)2 g NaCl2.5 g yeast extract5 g tryptone (or peptone)5 g NaCl5 g yeast extract10 g tryptone (or peptone)10 g NaCl2xTY3.2 g Tryptone2 g Yeast Extract1 g NaCl[用 5 N NaOH调 pH值至 7.0]8 g Tryptone5 g Yeast Extract2.5 g NaCl[用 5 N NaOH调 pH值至 7.0]16 g Tryptone10 g Yeast Extract5 g NaCl[用 5 N NaOH调 pH值至 7.0]SOC4 g Tryptone1 g Yeast Extract0.1 g NaCl2 ml KCl (250 mmol/L)1 ml MgCl2 (2 mol/L)4 ml Glucose (1 mol/L)10 g Tryptone2.5 g Yeast Extract0.25 g NaCl5 ml KCl (250 mmol/L)2.5 ml MgCl2 (2 mol/L)10 ml Glucose (1 mol/L)20 g Tryptone5 g Yeast Extract0.5 g NaCl10 ml KCl (250 mmol/L)5 ml MgCl2 (2 mol/L)20 ml Glucose (1 mol/L)Note: 1.溶液使用前，加入灭菌的MgCl2,2. SOC培养基除含有20 mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。
SOB培 养基经高压灭菌后冷至60°C或以下，加20 ml除菌的1 mol/L葡萄糖溶液（1 mol/L葡萄 糖溶液的配制方法是：用90 ml去离子水溶解18 g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水定 容至100 ml,用0.22 um滤器过滤除菌）。