实用pcr流程表

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1、临床PCR检验流程记录表检验日期： 检验项目： HBVDNA扩增仪中保存文件名使用说明：严格按单一流向进行实验，即试剂准备区一标本制备区一扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；各项 工作执行后在相应项目前的方框内打“丿”；本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。实验前准备试剂在有效期内扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年）生物安全柜的滤膜在使用有效期内离心管、带滤芯吸头已经过质检合格各区按消毒液配制SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70%酒精，即用即配。打开通风设备操作者试剂准备区实验前：更换专

2、用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（28C）C；冷冻室（-202C）C实验室温度。C （允许范围：1530C）；相对湿度：（允许范围：30%70%）PCR试剂来源：试剂厂家：口深圳匹基生物工程有限公司批号：检验项目：HBVDNA本次实验用量:人份； 剩余量：人份其他有关试剂配制：仪器设备使用:离心机：正常不正常；振荡器：正常 不正常；生物安全柜：口正常口不正常实验后：按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上.按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。操作者样本处理区实验前：更换

3、专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 冰箱温度:冷藏室（28C）C;冷冻室（-202C）C实验室温度。C （允许范围：1530C）；相对湿度：（允许范围：30%70%）HBV-DNA阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：HBV-DNA阴性室内质控物来源:批号：扩增位置：所处理的HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置:191725334149576573818921018263442505866748290311192735435159677583914122028364452606876849251321293745

4、536169778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加样过程：按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。仪器设备使用：生物安全柜：正常不正常；恒温金属浴：。C；离心机：正常 不正常；振荡器：正常 不正常；低温离心机:制冷：正常 不正常；离心：正常 不正常实验后：按实验室清洁消毒S0P清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上.按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。口使用后标本冷冻保存3个月，以备复查.操作者扩增及产物分析区实验前：更换专用

5、工作服、戴口罩、帽子、鞋套 实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 实验室温度。C （允许范围：1530C）；相对湿度：（允许范围：30%70%）LightCycler扩增仪操作：开机自检及运行正常；按LightCycler操作使用SOP进行编程、参数设定HBVDNA标准曲线计算值:Slope值：Intercept值：r2值：室内质控结果：阴性质控物结果：；阳性质控物结果：口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否 口是室内质控结果：阴性质控物结果：；阳性质控物结果：口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否 口是失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进

6、行）实验结果：见所附扩增仪打印结果实验结果有效性判断:有效无效（依据实验结果有效性判断SOP进行）实验后：按实验室清洁消毒S0P清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物.操作者1。 操作步骤:1.2.1取n个1。5ml的灭菌离心管，作好标记。（样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2 向上述离心管中分别加入 25ul 蛋白酶溶液。1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡1

7、5秒，充分混匀。（注意:不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。1.2.51.2.656摄氏度温浴15分钟。瞬时离心,以去除管盖上的滴液.加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。注意：如果环境温度超过 25 摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离心，以 去除管盖上的滴液。1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1。2。6中的液体移入核酸提取 柱中。盖上盖子,600O*g离心1分钟。倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入 收集管中。 （如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体,以更高的速度再次离心，确保 提取柱中无残余的液体）1.2.8小心

8、的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1,盖上盖子，6000*g离心1分 钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2,盖上盖子，6000*g离心1分 钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中.1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子,加入 500ul 无水乙醇,盖上盖子, 6000*g 离心 1分钟,丢弃收集管,将提取柱放入新的收集管中.1.2.1120000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。1.2.12 丢弃收集管,将核酸提取柱放入干净的 1。 5ml 离心管中,打开提取柱的盖子,56摄氏度温浴3分钟,以彻底去除残余

9、的液体。1.213将核酸提取柱放入另一干净的1。5ml离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入60ul洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央儿盖上盖子，室温静置5分钟。20000*g高速离心1分钟收集滤出液,做好标记, 4摄氏度保存备用.提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR扩增，或在一70摄氏度下可以保存一个月。2.扩增试剂准备（PCR前准备区）从试剂盒中取出HCV RTPCR反应液、Enzyme Mix ,在室温下融化后,2000*g 离心5秒。设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n（n=样本数+1管空白对照+1 管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标 准品

10、），每个测试反应体系配制如下表：试剂HCV RTPCR反应液Enzyme Mix用量n*13uln*2ul计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10 秒，向各玻璃毛细管中分装15ul,转移至样本处理区。3. 加样（样本处理区）吸取10ul样本处理步骤1。2。13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别 加入到上述反应管中（空白对照直接加入10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同Roche 专用金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。将 毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序.4。 RTPCR反应（检测区）4

11、.1 循环条件设置ProgramCyclesTemperature摄氏度IncubationTime(min:sec)Temperature Transition Rate( 摄氏度/sec)Acquisitio n ModeAnal ysisMod e115030:0020NoneNon e219515： 0020NoneNone3459500： 0520NoneQua5000： 3020Singlentifi7200： 2010Nonecation反应体系为25ul。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。4.2 仪器检测通道选择选择F1检测通道：HCV内对照(IC)选择F2检测通道。4.3

12、样本的设定在扩增开始前条件设定时，将HCV定量标准品设为“Standard”并输入试剂盒内 给定浓度值，待检样本和对照品设定为Unknown”。结果分析条件设定1. 对HCV的曲线和HCV内对照(IC)的曲线进行分别分析。2. 分析方式选择Fit Points，基线调整选择Arithmetic，阈值(threshold)设定原则以 阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常HCV阴性对照病毒滴度 为 0。 0IU/ml 为准.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。质控标准1. 将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横 坐标，以其实际测得的外标 Ct

13、 值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值 应大于等于0980,四个HCV定量标准品的Ct值都应V38.0，否则视为定量结果无效。2. HCV阴性对照、空白对照HCV RNA应为0.0IU/ml； HCV强阳性对照HCV RNA应 为 5。0E+O51。0E+07IU/ml;HCV 临界阳性对照应为 1。0E+031.0E+05 IU/ml； 且HCV阴性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照(IC)的Ct值都应小于等于33,否则此次实验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。结果判断1. 检测样本中1.0E+03 IU/ml小于等于HCV RNA小于等于5。0E+07 IU/ml,测定结

14、果 有效，可直接报告相应的浓度值.2. 检测样本中HCV RNA大于5.0E+07 IU/ml,可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦 可将该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测 定，测定结果应以稀释倍数进行校正。3. 检测样本中0.0IU/ml小于HCV RNA小于1。0E+03 IU/ml,且HCV内对照(IC)的Ct值都应小于等于33,表明病毒载量较低，可直接报告浓度值，但注明该病毒滴度 量仅供参考。4. 检测样本中HCV RNA等于0.0IU/ml，且HCV内对照(IC)的Ct值都应小于等于33, 应报告为小于试剂盒最低检测限。5. 检测样本中HCV内对照(IC)的Ct值大于33或Ct值为无数值，且HCV RNA小于 等于1。0E+03 IU/ml(包含 0.0IU/ml或无数值)时，则此样本的定量结果视为无效，应 查找并排除原因,并对此样本进行重复实验。