实验电镜切片制作与观察实验目的•:•了解扫描电镜生物样品的常规制备技术，重点掌握样品的表面处理方法，临界点干燥仪和离子溅射 仪的结构与工作原理•:•了解生物样品超薄切片的一般制备技术，重点掌握包埋与聚合、玻璃刀的制作、修块、铜网及其支 持膜、切片厚度判断等♦:♦了解H-7000透射电镜的结构及其工作原理，重点是镜筒系统实验原理1、 电子束的特点穿透能力有限，不超过 100nm2、 电子成像机制电子成像的反差主要源于样品散射电子能力的 差异3、 生物样品的特点含水量高、质地柔软、对热和电子束敏感，散射 电子的能力弱且差异小4、 扫描电镜及常规扫描电镜生物样品制备技术（1）扫描电镜扫描电镜是一种利用电子束扫描样品表面从而 获得样品信息的电子显微镜扫描电镜由三大部分组成：真空系统，电子束系统以及成像系统2） 扫描电镜样品制备要求扫描电镜以观察样品的表面形态为主扫描电镜样品的制备，必须满足以下要求：保持完好的组织和细胞形态；充分暴露欲观察的部位；良 好的导电性和较高的二次电子产额；保持充分干燥的状态3） 扫描电镜样品制备流程某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛 发、昆虫、植物种子、花粉等。
对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材 料的导电性和二次电子产额具体步骤包括：取材、清洗、固定、脱水、干燥（置换、）粘托、导电处理等5、透射电镜及超薄切片制备技术（1）透射电镜透射电镜是利用透射电子成像的电子显微镜透射式电子显微镜的总体结构包括镜体和辅助系统两大部分，镜体部分包含：照明系统（电子枪和聚 光镜）、成像放大系统（样品室、物镜、中间镜和投影镜）、观察记录系统（观察室、照相室）辅助系统包 含：真空系统（机械泵、扩散泵和真空阀）、电路系统（电源变换和调整控制）、水冷系统2）透射电镜样品制备要求样品彻底干燥、要提高样品反差、样品要薄3）超薄切片制备技术由于一般透射电镜的电子束穿透能力较弱，必须把标本切成厚度小于lOOnm的薄片，这种薄片称为超 薄切片，超薄切片的厚度通常为 50-70nm超薄切片的制作流程与石蜡切片类似，包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、修块、切片、染 色等步骤实验步骤1、常规扫描电镜样品制备技术1）基本方法令一般表面处理方法◊ 样品断裂面处理方法（3）干燥的干燥方法◊ 自然干燥法◊ 真空干燥法◊冷冻真空干燥法令临界点干燥法（临界点干燥仪）（4）样品的导电处理◊ 真空镀膜法◊ 离子溅射镀膜法（离子溅射仪）◊ 组织导电技术2、超薄切片制备技术（1）、基本方法取材一漂洗（生理盐水一前固定（2.5%戊二醛，4W冰箱2小时以上）一漂洗（0.1M磷酸缓冲 液/ 3次/ 45分钟）一后固定（1%锇酸1小时左右）一漂洗（0.1M磷酸缓冲液/3次/45分钟）一梯度 脱水一浸透、包埋聚合一超薄切片一饱和醋酸铀染色30分钟，柠檬酸铅染色5-8分钟。
透射电镜样品制作操作流程图（2）半薄切片◊玻璃刀◊半薄切片机◊ 修块（3） 超薄切片◊ 工具：超薄切片机、钻石刀、水槽◊超薄切片流程：切片f捞片f拨片f载网◊ 切片厚度（切片干涉色）◊ 载网◊ 支持膜（4） 电子染色◊ 醋酸双氧铀染色及铀污染◊ 柠檬酸铅染色及铅污染3、H-7000 型透射电子显微镜的主要结构（1）镜筒结构电子枪U乃 第-•聚光镜 第二聚光锐H 第三議光钺吃① 电蚩侧蚌我團物额汩八第一中间Wi> 第二中间锐m 第一投影锐（PD 第二投影遺卍專 观察室 观察与记录系 一 嶽•与最像室| 丫系端楼纵台2）电子光学系统在这个系统中，主要包括共用电源、高压电源、透镜电源、束偏转电源、控制电路、相机电源以及CRT显示电路电子控制系统3）真空系统和冷却系统H-7000 透射电镜的真空系统是有两套真空线路构成的， 因此，它拥有两套抽真空设备，即两三台油旋转泵和两台油 扩散泵；其他组成部分包括：真空管道、预抽管道、预抽室（胶 片干储装置）、潘宁规（PE）、普拉宁规（PL）、抽真空指令装置 和保险装置冷却系统包括：冷却水循环装置和整机冷却管道4、上机操作真空系统观察到的视野实验结论思考题：1、对比石蜡切片制作，描述常规扫描电镜生物样品制备流程、透射电镜超薄切片制作流程。
扫描电镜生物样品主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种 子等此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、 导电处理等简单过程即可进行观察如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装 台、镀膜处理，即可进行观察拍照另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等 均属此类对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不 当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视超薄切片技术由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于O.lum以下的薄片才适 用，这种薄片称为超薄切片常用的超薄切片厚度是50-70nm在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技 术是最基本、最常用的制备技术超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱 水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤2、 生物样品超薄切片制备过程中的难点操作有哪些？(1)取材:快;组织块要小,使电子束可以穿透;低温操作,减缓自溶性改变;避免损伤.(2) 固定固定是生物电镜术中最重要的一步，又有许多因素需要注意，如固定液的pH/浓度/渗透压/固定方式/温度/组织块大小等.固定的好坏又影响细胞精细结构的保存,只有良好的固定才能获得真实的形态学图像.(3) 脱水少量多次使样品完全干燥。
4) 渗透与包埋包埋剂要有适当粘度，能迅速而均匀地渗入标本，便于操作；能与脱水剂完全混溶；聚合要充分、均 匀且聚合前后体积变化极小，以保证细胞精细结构不受损害；有良好的切割性能，便于操作；耐受高速电 子束轰击，性能稳定；电镜下不显示细微结构，保证电镜图像的真实性5) 支持膜的制作耐高温、无磁性；平整；网孔要多，孔间距要小；廉价6) 超薄切片机的正确使用3、 叙述透射电镜H-7000的工作原理比较部分光学显微镜透射电镜光源可见光（日光、电灯光）电子源（电子枪）照明控制玻璃聚光镜电子聚光镜样本1mm厚的载玻片约10nm厚的薄膜放大成象系统玻璃透镜电子透镜介质空气和玻璃高度真空像的观察直接用眼利用荧光屏聚焦方法移动透镜改变线圈电流或电压分辨本领200nm0.2~0.3nm有效放大倍数103 X106 X物镜孔径角约700<10景深较小较大焦长较短教长像的记录照相底板照相底板通过电子显微镜与光学显微镜比较，便于理解其工作原理4、利用临界点干燥仪干燥样品时，样品盒放置滤纸的目的是什么？ 滤纸的干湿状态可显示溶解置换是否充分完成如置换不充分，重复一个浸泡和净化步骤5、离子溅射仪如何控制样品镀膜的厚度？ 溅射是入射粒子和靶的碰撞过程。
入射粒子在靶中经历复杂的散射过程，和靶原子碰撞，把部分动量 传给靶原子，此靶原子又和其他靶原子碰撞，形成级联过程在这种级联过程中某些表面附近的靶原子获 得向外运动的足够动量，离开靶被溅射出来溅射的特点是：（1）溅射粒子（主要是原子，还有少量离子等）的平均能量达几个电子伏，比蒸发粒子的平均动能kT高得多（3000K蒸发时平均动能仅0.26eV）,溅射粒子的角分布与入射离子的方向有关⑵入射离 子能量增大（在几千电子伏范围内），溅射率（溅射出来的粒子数与入射离子数之比）增大入射离子能量再增 大,溅射率达到极值；能量增大到几万电子伏,离子注入效应增强,溅射率下降3）入射离子质量增大, 溅射率增大4）入射离子方向与靶面法线方向的夹角增大,溅射率增大（倾斜入射比垂直入射时溅射率大）5）单晶靶由于焦距碰撞（级联过程中传递的动量愈来愈接近原子列方向）,在密排方向上发生优先溅射6） 不同靶材的溅射率很不相同6、描述通过透射电镜荧光屏看到的的海参上皮细胞海参上皮细胞X6000）海参上皮细胞细胞形状不规则，略呈圆形细胞核大较为松散；细胞质中细胞器含量较多，如线粒体和淀粉粒内有脂类空泡，细胞连接不明显注意事项：1.机枪必须检查各辅助设备是否正常，包括检查空气压缩机、循环冷却器、稳压电源、共有电源。
特别 应注意检查共用电源上的开关2.开机前须先打开循环冷却书器和稳压电源开关，确认仪器工作正常3•开机前确认全部阀门控制开关均处于EVAC的位置4.真空度知识低于 10-5Torr 时，不得开机5•更换样品（铜网）时，切记关闭灯丝电流6•开机程序切记：①关闭灯丝电流；②关闭高压；④退出样品；⑤关闭稳压电源及循环冷却水开关7. 上机人员必须经严格训练或在管理人员指导下工作。