高效液相色谱—串联质谱法测定动物肝脏中20种全氟烷基类化合物 摘要建立了QuEChERs-高效液相色谱-串联质谱〔HPLC-MS/MS〕同时测定动物肝脏中20种全氟烷基类化合物〔Perfluorinatedalkylsubstances，PFAS〕残留量的分析方法样品用0.1%HCl-乙腈振荡提取，C18、N-丙基乙二胺〔PSA〕和石墨化碳黑〔GCB〕净化，在C18色谱柱，以5mmol/LNH4Ac甲醇溶液和5mmol/LNH4Ac溶液为流动相进展梯度洗脱多反响监测〔MRM〕负离子形式，采用基质匹配同位素内标法和外标法结合进展定量分析20种PFAS在0.1～10μg/L浓度范围内呈线性关系，相关系数不小于0.995;检出限为0.05～0.2μg/kg，定量限为0.4～0.5μg/kg动物肝脏中20种PFAS的3个浓度程度〔0.5，2和5μg/kg〕加标的平均回收率为70.3%～108.1%，相对标准偏向〔RSD〕在2.1%～11.9%〔n=6〕之间关键词全氟烷基类化合物;QuEChERs;高效液相色谱-串联质谱;动物肝脏1引言全氟烷基类化合物〔PFAS〕是一类具有重要应用价值的含氟有机化合物，含有极高化学键能〔约为110kcal/mol〕的〖JG〔〗C〖ZJY〗F〖JG〕〗共价键，其稳定性高，具有疏油、疏水等特性，被广泛应用于纺织、造纸、包装、农药、地毯、皮革、洗发香波和灭火泡沫等工业和民用领域【1】。
PFAS可以经受很强的热、光照、化学、微生物作用和高等脊椎动物的代谢而不降解【2】，可以随食物链的传递在生物机体内富集和放大至相当高的浓度[3，4]，PFAS在生物体内的蓄积程度高于的有机氯农药和二恶英等持久性有机污染物的数百至数千倍【5】研究发现，PFAS具有诱发肝中毒、发育毒性、免疫毒性、内分泌干扰以及潜在致癌性等毒理效应[6，7]2021年，欧盟议会通过决议，规定欧盟市场上全氟辛烷磺酸在配制品中的含量不得超过产品质量的0.005%，半成品中不得超过0.1%，纺织品或塗料中不得超过1μg/m2，标志着欧盟正式全面制止全氟辛烷磺酸在商品中的使用[8]PFAS主要分布于动物的血液、肝脏、肾脏、心脏和肌肉等组织中，并以血液和肝脏中浓度最高因此，建立快速、灵敏、准确地测定动物肝脏中PFAS的方法尤为重要目前，检测PFAS的常用方法是高效液相色谱-串联质谱法〔HPLC-MS/MS〕，样品前处理多采用液液萃取或离子对试剂提取，WAX固相萃取柱[9～12]净化传统的前处理方法步骤繁琐、耗时长，方法重现性不好相比之下，以基质分散固相萃取为根底的QuEChERs〔Quick，Easy，Cheap，Effective，RuggedandSafe〕方法因其具有灵敏、高效、快速等特点，近年来被广泛应用。
HPLC-MS/MS技术具有高的灵敏度、选择性和重现性，是目前分析PFAS常用的方法[13]根据动物肝脏基质的特点，本研究采用QuEChERS方法对样品进展提取和净化，采用基质匹配同位素内标法和外标法结合进展定量分析，建立了基质校正HPLC-MS/MS同时测定动物肝脏中20种PFAS残留量的分析方法本方法简单、实用性强、分析速度快，可广泛用于动物类样品中PFAS的分析2实验部分2.1仪器与试剂ACQUITYUPLCTM超高效液相色谱仪配TQD三重四级杆质谱仪〔Waters公司〕;D160均质/分散机〔DragonLab公司〕;TRIOTM-1N型旋涡混合器〔ASONE公司〕;SR-2DS型程度振荡器〔TATEC公司〕;3-30K型高速冷冻离心机〔Sigma公司〕;N-EVAP112型氮吹仪〔OrganomationAssociates公司〕;Milli-Q超纯水仪〔Millipore公司〕;KQ-600B型超声波清洗器〔昆山市超声仪器〕全氟丁酸、全氟戊酸、全氟丁烷磺酸钾、全氟己酸、全氟庚酸、全氟己烷磺酸钠、全氟辛酸、全氟庚烷磺酸钠、全氟壬酸、全氟辛烷磺酸钠、全氟癸酸、全氟癸烷磺酸钠、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸、全氟十三烷酸、全氟十四烷酸、全氟十六烷酸、全氟十八烷酸、全氟壬烷磺酸钠、全氟戊烷磺酸钠和同位素内标13C4-全氟丁酸、13C2-全氟己酸、18O2-己烷磺酸钠、13C4-全氟辛酸、13C4-辛烷磺酸钠、13C5-全氟壬酸、13C2-全氟癸酸、13C2-十一烷酸、13C2-十二烷酸混合内标〔Wellington公司〕;甲醇、乙腈〔色谱纯，Fisher公司〕;乙酸铵〔色谱纯，AcrosOrganics公司〕;C18〔CNWBONDHC-C18，40～63μm，CNW公司〕，N-丙基乙二胺〔PSA，40～60μm，艾尔杰公司〕，石墨化碳黑〔GCB，CNWBONDCarbon-GCB，120～400目，CNW公司〕，实验用水为Milli-Q超纯水，其它未作特殊说明的试剂均为分析纯。
为防止引入高背景值，实验过程防止使用聚四氟乙烯材质的色谱管路和器皿2.2样品预处理2.2.1提取准确称取2.00g牛肝匀质样品置于50mL离心管中，参加适量内标，再参加4mL超纯水，漩涡混合1min后，参加0.1%盐酸乙腈10mL，均质1min后振摇10min，参加2gNaCl，再次振摇10min，13000r/min离心10min取上层乙腈相于15mL离心管中，40℃下氮吹约至4mL，以乙腈定容至4mL，待净化2.2.2净化将上述溶液转移至装有80mgC18、100mgPSA和40mgGCB填料的离心管中，振摇10min后，13000r/min离心10min，取上清液〔约4mL〕于另一离心管中，40℃下氮气吹至干，以1mL甲醇定容后，过0.22μm滤膜，HPLC-MS/MS分析2.2.3HPLC-MS/MS分析条件液相色谱条件：AtlantisT3色谱柱〔150mm×2.1mm，3μm〕;柱温：38℃;流速：0.2mL/min;进样量：10μL;流动相：A为5mmol/LNH4Ac-甲醇溶液，B为5mmol/LNH4Ac溶液;洗脱梯度：0～3min，10%～30%A;3～13min，30%～100%A;13～14min，100%～10%A;14～20min，10%A。
质谱条件：电喷雾离子源〔ESI〕;多反响标准曲线2.3.1外标曲线以阴性空白牛肝样品提取液〔操作同2.2节，但提取步骤不加内标溶液〕作为溶剂，将标准品稀释成0.1，0.5，1，2，5和10μg/L系列基质匹配标准溶液，以待测物的质量浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制外标曲线2.3.2内标曲线步骤同2.4.1节，其中每份标准溶液内都含1μg/L内标，以待测物的质量浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制内标曲线3结果与讨论3.1色谱条件的优化PFAS同时具有亲水性和疏水性，采用较低硅羟基活性填料的C18反相色谱柱可实现这类化合物的良好别离[14～16]通过对WatersXTerraC18柱、CapcellPakC18和AtlantisT3C18色谱柱进展比照，发现AtlantisT3C18的峰形与别离度效果最正确流动相选取乙腈-水、甲醇-水等进展比较，结果说明，以甲醇-水作为流动相，化合物别离度更好所测PFAS都是羧酸或者磺酸盐，在流动相中参加NH4Ac能使其保持一定的pH值及离子强度，减少拖尾，改善峰形[17]，有研究说明，较高浓度的NH4Ac对质谱检测有较强的抑制作用[18]。
因此，经过优化后，本实验采用AtlantisT3C18型色谱柱，以5mmol/LNH4Ac甲醇溶液和5mmol/LNH4Ac溶液进展梯度洗脱〔梯度洗脱条件见2.3节〕，20种目的物在20min内可实现良好别离，保存时间见表2PFOA和L-PFOS的标准溶液的MRM色谱图见图13.2质谱条件的优化由于目的物带有SO2Symbolm@@3，难于质子化，不宜采用ESI+形式，故本实验选取ESISymbolm@@形式进展扫描用针泵以20μL/min的流速分别注入100μg/LPFAS标准溶液，在m/z200～1000扫描范围内，以负离子形式进展一级质谱扫描，发现PFAS化合物峰较强，大部分化合物以电离后失去羧基上氢原子为主确定分子离子后，分别以其作为母离子，进展子离子扫描，选取丰度最强碎片离子作为定量离子，次强的碎片离子作为定性离子部分化合物打碎后的碎片离子少，只能找到一个离子最后，以选择反响监测〔MRM〕负离子形式优化锥孔电压、碰撞能量等参数，质谱条件见表13.3提取溶剂的选择PFAS属于酸性化合物，在酸性环境下呈分子状态，有利于进入有机相已报道的文献中采用0.1%HCl-甲醇溶液[19]、乙腈[20]、2%甲酸-甲醇溶液[21]等作为提取溶剂，提取尿液[13]、奶粉[19]和肝脏[21]等基质中PFAS。
在参考文献的根底上，本实验分别用乙腈、甲醇、0.1%HCl-乙腈溶液、2%甲酸-甲醇溶液、0.1%HCl-甲醇溶液、2%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂，比较不同提取溶剂对目的物的提取效率结果说明，用0.1%HCl-乙腈溶液提取的效率最好，在1μg/kg加标程度下，目的物的平均回收率为85.3%～117.2%，且不同目的物之间无明显差异，结果见图2最后，选择0.1%HCl-乙腈溶液为提取溶剂3.4净化方式的选择动物肝脏中存在色素、脂肪、甾醇等杂质，PSA可以吸附基质中的碳水化合物、有机酸和酚类，C18可以去除脂肪和酯类等，GCB可以去除色素、甾醇类等吸附剂粉末的用量直接影响前处理净化效果和目的物的回收率，用量小那么净化效果不明显，用量大，净化效果虽好，但回收率低，不能满足检测要求，为选择适宜的吸附剂粉末的用量，比较了3种不同的吸附剂净化的样品回收率用C18净化样品后的平均回收率大于80%，但重现性不好，且净化后的溶液有色素残留;PSA和GCB净化色素效果较好，但净化后的溶液有油脂残留为理解决以上难题，使用以上3种吸附剂的组合，在检测灵敏度、最正确净化效果和合理回收率之间寻求平衡点，使全部化合物获得满意的结果。
实验对不同比例PSA、C18、GCB〔1∶1∶1，2∶2∶1，2.5∶2∶1，3∶2∶1，w/w〕的净化效果进展了考察〔图3〕，结果说明，以2.5∶2∶1的质量比混合3种吸附剂PSA、C18、GCB获得最正确净化效果，20种PFAS平均回收率能到达73%～112%，背景值干净，加标样品的别离度和峰形均较好因此，选择混合吸附剂〔PSA，C18， GCB，2.5∶2∶1，w/w〕为净化吸附剂3.5基质效应以阴性空白牛肝样品提取液作为溶剂，配制1μg/L的混合标准溶液，测定其峰面积为A;以甲醇为溶剂配制1μg/L的混合标准溶液测定其峰面积为B基质效应ME〔%〕=B/A×100[22]，结果见表3其中ME>100%的为基质增强效应，ME<100%的为基质抑制效应可以看出，样品提取液对部分目的化合物存在一定的基质影响为保证定量分析准确性，本方法选择基质匹配的标准溶液进展测定3.6定量方式及线性关系在检测PFAS的过程中，通常情况下由于待测样品中PFAS的含量较低，因此在检测技术不够稳定以及仪器灵敏度有所限制的条件下，采用外标法定量测定会产生较大的误差，而内标法的使用会使这一问题迎刃而解，可最大限度地减少由仪器响应度所引起的误差【5】。
同时，由于存在基质效应，因此实验中以空白牛肝样品提取液作为溶剂配制混合标准系列溶液L-PFHpS、PFTrDA、L-PFPeS未寻找到性质一样的同位素内标，采用基质匹配外标法，其它17种PFAS采用基质匹配内标法进展定量分析，结果见表4在阴性样品中添加目的化合物，按照给定的方法测定，以3倍信噪比〔S/N〕对应的添加程度作为检出限〔LOD〕，10倍信噪比〔S/N〕对应的添加作为定量限〔LOQ〕，结果见表4结果说明，本方法LOD在0.05～0.2μg/kg之间，LOQ在0.4～0.5μg/kg之间3.7准确度和精细度实验选择1倍、4倍和10倍LOQ作为添加量，考察。