分析方法的方法学验证

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1、一、方法验证1. 准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为 80、100和 120的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。 可承受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在 98.0%-102.0%之间，9 个回收率数据的相对标准差RSD应不大于 2.0%。2. 线性 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为： 在 80至 120的浓度范围内配制 6 份浓度不同的供试液， 分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，进展线性回归分析。 可承受的标准为：回归线的相关系数R不得小于 0.998，Y 轴截距

2、应在 100响应值的 2 以内，响应因子的相对标准差应不大于 2.0%。3. 周密度 1重复性 配制 6 份一样浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能一样的条件下进展测试，所得 6 份供试液含量的相对标准差应不大于 2.0%。 2中间周密度 配制 6 份一样浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进展测试，所得 12 个含量数据的相对标准差应不大于 2.0%。4. 专属性 可承受的标准为：空白比照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分别，分别度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进展纯度分析时，主峰的纯度因子应大于 980。5. 检测限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 3。

3、6. 定量限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 10。另外，配制6 份最低定量限浓度的溶液，所测6 份溶液主峰的保存时间的相对标准差应不大于 2.0%。7. 耐用性 分别考察流淌相比例变化5、流淌相 pH 值变化0.2 、柱温变化5、流速相对值变化20时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可承受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于 2.0，主峰与杂质峰必需到达基线分别；各条件下的含量数据n=6的相对标准差应不大于 2.0%。8、系统适应性 配制 6 份一样浓度的供试品溶液进展分析，主峰峰面积的相对标准差应不大于 2.0%，主峰保存时间的相对标准差应不大于 1.0%。另外，主峰的拖尾因子不

4、得大于2.0，主峰与杂质峰必需到达基线分别，主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。二、 分 析 方 法 验 证 Validation进展验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。从本质上讲，方法验证就是依据检测工程的要求，预先设置肯定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所承受的分析方法符合检测工程的要求。方法验证在质量掌握上有重要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是制订质量标准的根底。方 法 验 证 内 容包括方法的专属性、线性、范围、准确度、周密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等， 检测目的不同验证要求也不尽一样。1. 专 属

5、 性 Speciality / Specificity专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为“选择性”。对于纯度检测，可在标准品中参加产品中的杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反响体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进展色谱峰纯度检查。一般要求产品和杂质之间的分别度大于 2.0。2. 线 性 Linearity线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原料或产品的浓度呈线性关系的程度。线性是定量检测的根底，需要定量检测的工程都需要验证线性。一般用贮备液经过周密稀释，或分别周密称样，制备得到一系列被测物质的浓度

6、5 个以上，按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用最小二乘法进展线性回归计算，考察分析方法的线性。3. 范 围 Range范围指在能够到达肯定的准确度、周密度和线性时，样品中被分析物 的浓度区间。简洁的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓 度最大值和最小值。需要定量检测的分析方法都需要对范围进展验证， 纯度检测时，范围应为测试浓度的 80120。4. 准 确 度 Accuracy准确度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做“真实度”，需要定量得分析方法均需要验证准确度。准确度应在规定的范围内建立，对于原料药可用纯度的标准品或符合要求的原料药进展测定，必要时可与另一

7、个已建立准确度的方法比较结果。5. 精 密 度 Precision周密度是指在规定条件下，同一均匀样品经屡次取样进展一系列检测所得结果之间的接近程度。周密度一般用相对标准偏差RSD表示， 取样检测次数应至少 6 次。 周密度可以从三个层次考察：重复性、中间周密度、重现性。a、重复性Repeatability：是在一样的操作条件下、较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的周密度。一般是用100浓度水平的样品测定 6 次的结果进展评价。b、中间周密度Intermediate precision：同一试验室，在日期、分析人员、仪器等内部条件转变时，测定结果的周密度。c、重现性Reproducib

8、ility：指不同试验室之间不同分析人员测定结果的周密度。6. 检 出 限 Limits of Detection；LOD检出限是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，不需要准确定量。检出限表达了分析方法的灵敏度。检出限的测定可以通过对一系列浓度被测物的试样进展检测，以能准确、牢靠检出被测物的最小浓度来确定，也可把浓度样品的信号与噪声信号进展比较，以信噪比为 3：1 时的浓度确定检出限，一般要求能够到达进样浓度的0.05%。7. 定 量 限 Limits of Quantitation / Quantification；LOQ 定量限是指样品中的被分析物能够被定量检测的最低量，其测定结果需要

9、肯定的准确度和周密度，定量限表达了分析方法灵敏定量检测的力量。检测需要严格掌握含量的杂质，必需考察方法的定量限，以保证杂质能够被准确定量。一般以信噪比为 10：1 时相应的浓度或进样量来确定定量限。8. 耐 用 性 Durability / Robustness耐用性是指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度， 耐用性主要说明方法的抗干扰力量，主要的变动因素包括：流淌相的 组成、流速和 pH 值、色谱柱、柱温等。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。9. 系 统 适 用 性 试 验System Suitability液相色谱分析方法主要依靠高效液相色谱仪

10、和色谱柱，在做方法验证时，有必要将高效液相色谱仪、色谱柱、流淌相与试验操作、待测样品等一起当作完整的系统进展评估，并将系统适用性作为分析方法的组成局部，系统适用性便是对整个系统进展评估的指标。一般系统适应性的要求为：分析方法能够到达0.05%的检出限；主峰的拖尾因子T0.95T1.05 时最抱负峰高定量时，峰面积定量时：T2；主峰与杂质的分别度R应大于2.0；理论塔板数n应符合规定；空白干净，主峰处无系统峰干扰。分析方法开发与验证是一个整体，在实际工作中，一般是先开发分析方法，经过适当的优化以后再做方法验证，验证的局部内容在分析方法开发时就要做，比方说分析方法的专属性验证。分析方法验证并非必需验证全部的内容，只要留意验证内容充分，足以证明分析方法的合理性就可以了，如杂质限度检测一般只需要验证专属性和检出限，而周密度、线性、定量限等涉及定量测定的工程，则不需要验证。有时需要对分析方法进展全面或局部的再验证。当原料药合成工艺发生转变时，可能引入的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进展验证，以证明有关物质检查方法能够检测引入的杂质，且引入的杂质对主成份的含量测定应无干扰。当分析方法发生局部转变时，如检测波长发生转变，则需要重进展检测限、专属性、准确度、周密度、线性等内容的验证，以证明转变后的 分析方法的合理性、可行性