毛细管电泳的基本原理及应用

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1、毛细管电泳的基来源根基理及利用之杨若古兰创作 摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压 直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间淌度和分配行为 上的差别而实现分离的电泳分离分析方法 .该技术可分析的成 分小至无机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等 .可用于分 析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比 HPLC分析高效、快速、微量.关键词：毛细管电泳 道理 分离模式 利用1概述毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为 分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术.CE 的历史可以追溯到 1967 年瑞典 Hjerte

2、n 最早提出在直径为 3mm 的毛细管中做自在溶液的区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis ，CZE).但他没有完整克服传统电泳的弊病1.此刻所说的 毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出， 他们使用了 75mm 的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现 了分离.1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电 泳的次要分支：胶束电动毛细管色谱(MEKC).1987年Hjerten等 把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行.同年，Cohen发表 了毛细管凝胶电泳的工作.近年来，将液相色谱的固定相引入毛 细管电泳中，又发

3、展了电色谱，扩大了电泳的利用范围.毛细管电泳和高效液相色谱（H PLC） 样，同是液相分离 技术，是以在很大程度上 HPCE 与 HPLC 可以互为弥补，但是 不管从效力、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示 了必定的上风毛细管电泳（ C E） 除了比其它色谱分离分析方 法具无效力更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、利用面同 样广泛等长处外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单. C E只需高压直流电源、进样安装、毛细管和检测器.毛细管电泳具有分析速度快、分离效力高、试验成本低、 耗费少、操纵简便等特点，是以广泛利用于分子生物学、医 学、药学、材料学和与化学有关的化工、环保、食品、

4、饮料等 各个领域2.2毛细管电泳的设备和基来源根基理毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直 流电场为驱动力，根据样品中各组分之间淌度和分配行为上 的差别而实现分离的电泳分离分析方法 3.毛细管电泳仪的基本 构成如图1、1所示 .熔融石英毛细管的两端分别浸在含有电解缓冲液的贮液瓶 中，毛细管内也充满同样的电解缓冲液.在毛细管接收端之前安 装在线检测零碎.被分析样品可以从进样零碎采取重力法、电迁 移法、抽真空法等多种进样方式引入到毛细管的进样端.当样品 被引入后,便开始在毛细管两端施加电压 .样品溶液中溶质的带 电组分在电场的感化下根据各自的荷质比向检测零碎方向定向 迁移.CE中的毛细

5、管目前大多是石英材料.当石英毛细管中充入 pH值大于3的电解质溶液时,管壁的硅羟基(-SiOH)便部分解离 成硅羟基负离子(-SiO-)，使管壁带负电荷在静电引力下，-SiO-会 把电解质溶液中的阳离子吸引到管壁附近，并在必定距离内构 成阳离子绝对过剩的扩散双电层 (见图 24).在外电场感化下 ,上述阳离子会向阴极挪动.因为这些阳离 籽实际上是溶剂化的(水化的)，它们将带着毛细管中的液体一路 向阴极挪动，这就是CE中的电渗流(EOF)电渗流的强度很高， 乃至于所有进入毛细管中的样品，不管是阴离子、阳离子或中 性分子，都会随着液体向阴极挪动.因待测样品中正离子的电泳 方向与电渗流方向分歧，故最

6、早到达毛细管的阴极端;中性粒子 的电泳速度为零 ,迁移速度与电渗流速度相当；而负离子的电泳 方向则与电渗流方向相反，但因电渗流速度约等于普通离子电 泳速度的57倍，故负离子也将在中性粒子以后到达毛细管 的阴极端.因为各种粒子在毛细管内的迁移速度纷歧致，因此使 各种粒子在毛细管内能够达到很好的分离.3毛细管电泳的分离模式才根据分离道理分歧，CE分离基本模式有6种，如表1所 示.表 1 毛细管电泳的分离模式和利用Tab. 1 Separation modes and application of CE 以上各模式以毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动毛 细管色谱这3种利用较多.4毛细管电泳的利

7、用4.1 CE在药物成分分析中的利用目前，CE在天然中草药分析领域中的利用次要集中在生物 碱和黄酮及其甙类方面、蒽醌类分析也有报导.生物碱有类似于 碱的性质，在pH 11） ，使糖基上的羟基去质子而带负电荷，直接进行电 泳分离，用紫外（195nm）检测也能够选用硼酸盐缓冲液，硼 酸盐与糖基络合构成带负电荷的络合物以进行电泳分离，用紫 外检测.简单单糖的分析方法也适于简单寡糖的分析12.多糖普通 利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后进行分析.糖蛋白经蛋 白酶酶解后生成糖肽，糖肽的图谱被认为是糖蛋白的指纹图谱. 糖肽的分离主如果基于其pKa值的分歧而进行CE分离，其实 不是基于糖链结构的分歧， 是

8、以所选用的缓冲液的构成及其 pH的选择尤其次要，其检测也是基于蛋白质的检测糖脂既可 以直接用CE分离，也能够用神经酰胺聚糖酶将糖链释放出来 后进行分析糖胺聚糖（GAG）类糖基的聚糖部分有透明质酸、 硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素等，普通都含有反复的二糖单 元，而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖，这些寡糖既带 电荷又有紫外接收（232nm），是以很适合用CE进行分析另 外，CE在糖型分析方面也取得了较大的成功在糖的检测方 面，紫外分析是最早用于CE进行糖类检测的，但它的灵敏度 绝对不高，检出限普通只要106mol数量级.利用激光引诱荧光 检测对糖类进行柱前高效荧光标识表记标帜，可使检出限达到 1

9、0-9mol水平.在改进检测零碎的同时，中性糖类的极性标识表 记标帜也在不竭改进与完美.其中一种极性标识表记标帜物为8- 氨基-萘-1，3，6-三磺酸，利用其可以快速高效地对均一寡糖和 复杂多糖进行分离分析，具有很高的分辨率.4.5 CE在临床化学上的利用CE 在临床化学中的利用十分广泛, 所检测样品的来源可分 为尿样、血浆血清、脑脊液、红细胞、其它体液或组织和实验 动物活体(invivo)试验.被分析的组分则包含肽类、各种蛋白、病 毒、酶、糖类、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、离子、 药物及其代谢产品.具体利用可分为: 临床疾病诊断 临床蛋白分 析、 临床药物监测、代谢研讨、病理研讨、同

10、工酶分析、聚合 酶链反应(PCR )产品分析、DNA片断及序列分析等所利用的 CE 模式包含 CZE、MECC、CGE、 CITP 和毛细管等电聚焦 (CIEF)13.14.4.6 CE用于检测非均一性(多样性,Heterogeneity)很多纯化蛋白, 甚至在它们的天然形态, 常常都不是单一分 子片断, 而是由相干分子构成, 称为非均一性(多样性).发生多样 性的缘由有：氨基酸(AA)的序列分歧，如突变体的某地位AA改 变或 AA 侧链改变; 后转译发生分歧长度的多肽链; 糖蛋白分歧 程度的糖基化, 如存在分歧数量的寡糖链, 寡糖链有分歧的单糖 构成、 序列及单糖之间的异构连接. 采取 CZ

11、E, MECC, CIEF, CE-MS 可检测这些非均一性.用于心脏病的重组人组织血纤维蛋 白溶酶原激活剂(rtPA)含4个可能糖基.Yim 15用CZE和CIEF 研讨了制备过程中 rtPA 分歧糖基化程度惹起的非均一性, 结果 标明, CIEF 方法要比 CZE 的好.还有效 CZE 对人促红细胞生成 素(rHuEPO )16、用MECC对重组人C2干扰素(IFN2C)g及CE- MS18研讨蛋白的多样性.有关蛋白的非均一性在临床中的一些利 用,如人铁传递蛋白、血清蛋白的变异、异构酶的分析等.4. 7 CE用于农药残留量的分析对农药残留物的测定国外研讨的较多.Lazer等卩9将飞行时间

12、质谱和毛细管电泳仪联用，采取样品堆积技术进样对 Paraquat 和Diquat两种除草剂进行了分离，检测限低至10- wmol/L.Farran 等20采取久乙腈）=50 %的磷酸-硼砂缓冲液分离出两种苯氧羧酸 类除草剂.Hinsmann等囚通过主动在线浓缩样品，采取固相微柱 以十二烷基硫酸钠（SDS）作胶束，添加少量乙腈，在13min内分离 测定了水中的7种分歧品种的农药.磺酰脲类化合物是一类绝对 较新的除草剂，是以这一类化合物在水和食品中的残留量的测 定十分次要.Lipez Avila等22采取3ymODS硅胶填充柱来分离这 一类化合物，线性范围为1100mg/L.Mayer等报导了农药 Cinosulfuron及其副产品的毛细管电色谱的分离分析.游静等23对 毛细管电泳在农药手性拆分的进展做了综述.4.8 CE用于纯度检测CE在国外分子生物学实验室及生物工程药厂里已广泛用作 最无效的纯度检测手段当蛋白的疏水性附近时，它们在HPLC 柱中常常同时流出，是以在对蛋白进行结构研讨（包含N端序列 和肽谱）之前，必须监测从HPLC所得肽片断的纯度快速CE纯 度检测可节约样品和节省序列测定所需时间個CE和RP2 HPLC分离机理分歧，所以当用CE检查由RP2HPLC纯化制得 的某一合成肽（一个峰,纯度为 99