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1、淀粉酶活力的测定方法 萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定 实验报告 萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定 一、研究背景及目的 酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成少数为RNA。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反响，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反响过程。酶是细胞赖以生存的根底。细胞新陈代谢包括的所有化学反响几乎都是在酶的催化下进行的。因此，对酶的研究是十分重要的。通过对酶活性的测定，可以更好地了解生物体的代谢过程。 其中，淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，可以分成-淀粉酶，-淀粉酶等。-淀粉酶既作用于
2、直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差异地随机切断糖链内部的-1，4-链。-淀粉酶与-淀粉酶的不同点在于从非复原性末端逐次以麦芽糖为单位切断-1，4-葡聚糖链。 根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化产生的麦芽糖毫克数。 3,5二硝基水杨酸法是一种对复原糖定量测定的方法。复原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与复原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中复原糖以及总糖的量。麦芽糖是复原性糖，可用该方法对其含量进行测定。 本次实验的目的在于通过实验过程，理解淀粉酶测定的原理，熟悉实验操作，掌握实
3、验方法。 蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质，对生物来说十分重要。目前有四种蛋白质含量测定方法：凯氏定氮、Folin-酚法、染料结合法、紫外法，最常用的是后三种。 本次实验选择通过Folin-酚法测定蛋白质含量。这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之 一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。 二、实验原理 该实验的总体思路为精确控制酶促反响的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反响的初速度来表示酶的活力。以及通过化学反响使得蛋白质具有特异光吸收，再通过比色法测定蛋白质含量。 该实验的理论
4、根底为： 1酶的性质：淀粉酶是蛋白质，在一定的条件下会发生钝化，可利用此性质将体系中的非目标酶类钝化，从而测出目标酶类的活力； 23,5二硝基水杨酸法：3,5二硝基水杨酸法是一种对复原糖定量测定的方法。复原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与复原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中复原糖以及总 糖的量。麦芽糖是复原性糖，可用该方法对其含量进行测定。 具体反映为： 在加热、碱性条件下：3,5二硝基水杨酸黄色+复原糖3-氨基-5-硝基水杨酸棕红色+糖酸； 3比色法原理：朗伯比尔定律当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光
5、物质时,与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比。 三、仪器试剂 1、仪器设备：上海精宏实验设备DK-S24型40水浴锅；天津市中环实验电炉22列八孔型70电热恒温水浴锅；上海安亭科学仪器厂TDL-408型低速离心机；上海精密科学仪器722型光栅分光光度计；DCL-2000 DY型电磁炉佛山市爱庭电器。 2、主要实验器皿：50ml容量瓶，100ml容量瓶，研钵一套，具塞刻度试管假设干，试管假设干，烧杯。 3、试剂： 1麦芽糖标准液1mg/ml； 2pH5.6的柠檬缓冲液： A液称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L B液称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L 取A液5.5ml、
6、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液； 33，5-二硝基水杨酸溶液称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，参加50ml蒸馏水，再参加30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入； 4麦芽糖标准液称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容到100ml； 50.4M NaOH； 6试剂甲： A 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 KNaC4H4O64H2O。溶解于500毫升蒸馏水中。 B 0.5克硫酸铜CuSO45H2O溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份
7、A与1份B混合，即为试剂甲。 7试剂乙： 在2升磨口回流瓶中，参加100克钨酸钠Na2WO42H2O,25克钼酸钠Na2MoO42H2O及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，参加150克 硫 酸 锂Li2SO4，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色如仍呈绿色，须 再重复滴加液体溴的步骤。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。 8牛血清蛋白标准溶液250g/ml。 4、实验材料：萌发的小麦种子。 四、实验步骤 1酶液的制备蒸馏水浸提： 称取2克萌发的小麦种子芽长一厘米左右，置于研钵中加少量石英砂，蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后3500转/别离心20分钟，取出上清液备用初始酶液。 2淀粉酶活性的测定： A.取试管4支，注明两支为对照管，两支为测定管。
