组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台浅层全关节软骨缺损的修复作用?982?中华实验外科杂志2006年8月第23卷第8期ChinJExpSurg.August2006,Vol23,No.8组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台浅层全关节软骨缺损的修复作用陈雷杨志明林建华李秀群【摘要】目的探讨组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台外侧髁浅层全关节软骨缺损的修复作用,并检测其修复组织的软骨类型.方法取2周龄乳兔软骨细胞体外培养传代至第3代后,与人胎盘I型胶原蛋白海绵复合后植入成年兔的胫骨平台外侧髁完全软骨缺损区,并设立空白对照组,分别于术后4,12,24周取材.观察修复效果.运用天狼星红染色检测I型胶原,Ⅱ型胶原单克隆抗体检测II型胶原的表达.结果实验组术后4周缺损表面未见日月显的新生软骨形成,组织学切片上少数几个呈上皮样生长的软骨细胞,苏木素一伊红(HE)染色胞浆呈深蓝色,周围软骨基质染色成浅蓝色;12周,缺损表面有少量的新生软骨形成,组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的,小蜂窝状结构,软骨细胞周围有软骨陷窝形成;24周,缺损表面的新生软骨较4,12周的新生软骨明显,表面光滑,且与周围组织结合紧密,但仍存在部分缺损尚未修复,组织学切片上可见软骨细胞呈边缘不规则的,多层细胞的蜂窝状结构,软骨细胞周围有软骨陷窝形成,并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质.而对照组则均未见明显的修复;随着术后时间的延长,I型胶原的表达呈逐渐减弱的趋势,而Ⅱ型胶原的表达呈逐渐增强的趋势.结论该方法制成的组织工程软骨对兔胫骨平台外侧髁全层软骨缺损有修复作用,运用该方法不能完全修复兔胫骨平台外侧髁软骨完全缺损;形成的新生软骨为透明软骨样组织.【关键词】组织工程;关节软骨;缺损;修复Researchofrepairingtherabbitlargearticularcartilagebytissue-engineeringcartilageCHENLei,YANGZhi—ruing,LINJian—hua,eta1.DepartmentofOrthopaedics,The￡AffiliatedHos—pitalFujianMedicalCollege,Fuzhou350005,ChinaCorrespondingauthor:YANGZhi—ruing【Abstract】ObjectiveToinvestigatethefeasibilityofrepairingthewholelayercartilagedefectsoflateraltibialplateauofrabbitsbyimplantingtissue—engineeringcartilage.Metl10dsTakethechondro—cytesof2-week—oldrabbits,cttltureandtransfertothe3generation,mixedwithhumanplacentacoUagenI—spongeandtransplanttOthewholelayercartilagedefectsofadultrabbitinlateraltibialplateau,ob—servetherepairresultsafter4,12and24weeks,Detectthecollagentype1withsiriusredstain,im—munohistochemicalassaywithanti—collagentypeⅡ.ResultsNearlynoobviousneo~cartilageformed4weeksafteroperation,fewepithelioidchondrocytes,cellplasmaisblue,thecartilagematrixsurroundingislightblue,HEstain;smallquanitityneo-cartilageformed12weeksafteroperation,fewepithelioidchon—drocytes.cellplasmaisblue,thecartilagematrixsurroundingislightblue,HEstain;moreobviousneo-cartilageformedthanin4and12weeksafteroperation,thesurfaceissmooth,integratewellwithsur—roundingtissues,butstiHexitpartialdefectsremained,thechondrocytesshowirregulmrinmargin,honey—combstructurewithmulti—laminacells,lacunaformedsurroundingthechondroeytes,neo~chondrocytesshowsbrownishred,toluidinebluestain,cartilagematrixdiscolorreactionwithtoluidinebluesurroundingthecells,theceUsisnotwelldistributed.Noobviousrepairevidenceonthesurfaceofthecontrolgroup;Withthetimegoingafteroperation,thepositiveexpressionofcollagentypeIWasfromstrongtOweak,whereascollagentypeⅡWasfromweaktostrong.ConclusionThetissue—engineeringcartilagebythismethodcanrepairthedefectsofthewholelayercartilagedefectsoflateraltibialplateauofrabbits,butitcannotrepairthedefectscompletely;Therepairtissuebeconfirmedtobehyalinecartilage.【Keywords】Tissue-engineering;Articularcartilage;Defectrepair基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(973);国家自然科学基金资助项目(39830100);福建省科技计划重点项目(2004Y018)作者单位:350005福州,福建医科大学附属第一医院骨科(陈雷,林建华);四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室修复重建外科研究室组织工程实验室(杨志明,李秀群)通讯作者:杨志明?实验研究?中华实验外科杂志2006年8月第23卷第8期ChinJExpSuAugust2006.V0l23.N0我们通过本研究采用取兔膝关节胫骨平台外侧髁浅层全关节软骨损伤作为模型,运用同种异体软骨细胞复合胶原蛋白海绵,在生理负荷下修复关节软骨缺损,观察修复效果,并运用天狼星红染色检测I型胶原,Ⅱ型胶原单克隆抗体检测Ⅱ型胶原.材料与方法1.细胞培养和传代:取2周龄乳兔关节软骨,磷酸盐缓冲液[PBS(含青霉素,链霉素各200U/m1)]冲洗3遍,37℃水浴中,0.25%胰蛋白酶(Sigma)消化30min,剪碎软骨至0.5mm的小块,加入0.2%Ⅱ型胶原酶(Sigma),37℃水浴振荡4～6h(中间隔1h收集细胞1次).加含血清DMEM液终止消化,计数,离心,按1×10.个/瓶的细胞密度接种,加入20%小牛血清DMEM液,37℃,5%cO2,饱和湿度培养,视细胞生长情况隔日换液,传代,培养3～4周至第3代,备用.2.材料准备:将人胎盘I型胶原蛋白海绵(上海其胜制剂实业公司)剪成1cm×1cm大小,预湿后,以细胞浓度为1.2×10个/ml,置入孵箱(37℃Ⅱ型胶原的检测:天狼星红(中山公司)染色检测I型胶原,Ⅱ型胶原单克隆抗体(Gene公司)免疫组织化学染色检测ⅡⅡ型胶原的表达:I型胶原染色阳性者,I型胶原纤维呈红色;Ⅱ型胶原阳性染色者在软骨细胞膜和软骨基质中有棕黄色颗粒沉着.在术后4周的标本中,I型胶原染色呈强阳性,术后12周染色中等,而在术后24周的标本中,I型胶原染色弱;Ⅱ型胶原在术后4周呈弱阳性,12周染色中等,24周时则呈强阳性表达.随着术后时间的延长,I型胶原染色从强到弱,而Ⅱ型胶原染色从弱到强的趋势.讨论目前运用组织工程方法修复关节软骨损伤的方法很多,主要有以下几个方面:(1)细胞来源;(2)生物材料;(3)调控因子.细胞来源主要包括自体来源,异体来源以及基质干细胞.培养系统多采用三维培养系统,将生物材料作为载体,以保证足够量的细胞种植在器官上,并为细胞生长提供三维空间,同时提供了细胞外基质样的结构L1J.虽然修复关节软骨缺损的方法较多,但大多数的结果仍然无法令人满意,缺损区多为纤维组织或纤维软骨充填,而且由于缺乏正常关节软骨的力学特性而导致修复组织随时间的延长而发生退行性改变L2J.关节软骨的损伤可分为两种,一是未达软骨下骨的损伤,即浅层的关节软骨损伤,诸多实验已经证明,该种损伤无法自行修复.没有局部血管扩张,渗出和血肿形成的过程,因而没有纤维蛋白凝块形成以作为修复组织长入的支架,结果只能由残余的软骨细胞修复,但为数不多的细胞代谢活力有限,最终无法修复.另一种损伤是深度关节软骨损伤,当软骨损伤深达软骨下骨伤及血管时,可引起修复反应.损伤所造成的缺损很快充满血液,血肿迅速形成富有纤维蛋?984?中华实验外科杂志2006年g月第23卷第8期ChinJExpSurg,August2006,Vol23,No.8白的凝块,其中含有血细胞和骨髓的成分,白细胞以及来自骨髓的和来自内皮组织的未分化细胞转变成原始的成纤维细胞,随着毛细血管的长入,纤维蛋白凝块形成含有血管和成纤维细胞的修复组织.这种修复的肉芽组织中,纤维组织进一步形成,转变成疏松的纤维血管网状结构,血管逐渐减少,而细胞成分逐渐增多,最终形成类似透明软骨的组织.目前,在软骨组织工程中,多采用同种异体的软骨细胞作为种子细胞,其优点在于来源较方便,在较短的时间内可获得较多的细胞量.因此,在本文中采用同种异体的软骨细胞作为种子细胞.软骨细胞在培养4代以内仍能保持软骨细胞的生物学特性,若继续传代,在培养过程中软骨细胞会逐渐失去其特异性表型,软骨细胞的标记性蛋白Ⅱ型胶原蛋白的合成,分泌减少,而I型和Ⅲ型胶原蛋白的合成和分泌增多,软骨细胞失去原有的高分化特性,即反分化现象】.已有研究表明,第3代软骨细胞的增殖能力优于原代细胞,人胎盘I型胶原蛋白海绵的孔径作为小孔径(25～100m)的支架材料,对细胞具有较好的吸附性,具有良好组织相容性和降解性J.因此,作者采用了第3代的软骨细胞作为种子细胞,与支架材料人胎盘I型胶原蛋白海绵复合制成组织工程软骨修复兔的浅层全关节软骨缺损.近年来,关于修复关节软骨全层缺损的研究屡见报道.Liu等J运用猪自体软骨细胞复合聚乳酸(PGA)及Pluronic修复猪的膝关节大面积的关节软骨缺损,结果显示,术后24周可见典型的透明软骨形成,与周围正常软骨,松质骨之间有理想的修复界面,其酸性黏多糖(GAG)含量高达80%.Schaefer等J运用同种异体软骨细胞复合PGA在体外联合培养4～6周形成组织工程软骨后植入免股骨髁负重面全层。