地鼠肾细胞培养狂犬病疫苗生产流程姓名：任菲菲学号：10910010120专业：生物工程狂犬病作为危害人类健康的最古老的疾病之一流行于世界大多数的国家和地区据统计，每年都有不少于4000人死于狂犬病发作狂犬病疫苗作为对抗狂犬病的唯一有效方法也随之经历了漫长的发展过程目前世界上存在很多狂犬病疫苗的生产技术，本文讲述的是应用细胞毒株制备狂犬病地鼠肾细胞纯化疫苗将狂犬病CaG株在原代地鼠肾细胞传代适应，用病毒培养液上清作为产生用毒种，结果通过在地鼠肾细胞传10代左右，适应后病毒液度较高1生产流程—>—>—>—>—>细胞制备种子批建立种子检测病毒接种和培养病毒收获病毒灭—>—>—>活合并、浓缩、纯化原液检定分装及冻干2主要流程简单说明2.1细胞制备生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞选用12—14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，分散细胞，接种培养瓶，用适宜的培养液进行培养来源于同一批地鼠、同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批培养液为含适量灭活小牛血清和乳蛋白水解物的MEM,199或其他培养液2.2 种子批的建立生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或其他经地鼠细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。
原始种子批为2aG],主种子批应不超过4aG毒种在地鼠肾原代细胞和豚鼠脑内交替传代制备工作种子批,在地鼠肾原代细胞的传代应不超过第6代,即不超过10aG；在豚鼠脑内传代应不超过第5代，即10aG52.3 种子检测用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性将毒种作10倍系列稀释,取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合,同时设立正常血清对照组,试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只，每只脑内接种0.03ml,观察14天,中和指数应不低于500取毒种作10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠至少6只，每只脑内接种0.03ml，观察14天，病毒滴度应不低于8.0LgLD50/ml用主种子批毒种制备灭活疫苗，腹腔注射体重为12-14g小鼠，每只0.5ml7天后重复接种1次作为试验组，未经免疫小鼠做对照组第一次免疫后的第14天，试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击，每只0.03ml，每个稀释度10只小鼠保护指数应不低于1002.4 病毒接种和培养当细胞培养成致密单层后，毒种按0.01－0.1MOI接种（同一工作种子批应按同一MOI接种），置适宜温度下培养一定时间后，弃去培养液，用无菌PBS或其他适宜洗液冲洗去除牛血清，加入适量维持液，置33-35°C继续适当时培养间。
2.5 病毒收获经培养适宜时间收获病毒液，即为病毒单次收获液根据细胞生长情况，可换以维持液进行多次病毒收获同一细胞批的同一次病毒收获液经检定合格后可合并为单次病毒收获液2.6 病毒灭活病毒收获液中按1：4000的比例加入甲醛溶液（应在规定的蛋白浓度范围内进行病毒灭活），置适宜温度、在一定时间内灭活病毒病毒灭活到期后，每个灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验2.7 合并、浓缩、纯化同一细胞批制备的多个单次病毒收获液检定合格后可合并为一批，经超滤或其他适宜方法浓缩至规定的蛋白质浓度范围经浓缩后的病毒液采用柱色谱法或其他适宜的方法纯化纯化后可加入适量人血白蛋白作为稳定剂，即为原液3总结通过对狂犬病毒aG株在金黄地鼠肾细胞上传代培养,获得一种新型狂犬病毒毒株,即地鼠肾细胞适应株（CaG株）由于该毒种具有生产方法简单,成本低廉,且外源因子污染机率小等优点,因此试用该毒种生产精制狂犬病疫苗在相同条件下,分别用豚鼠脑毒种和细胞毒种各生产3批病毒原液,经相同纯化工艺制备成精制狂犬病疫苗经初步检定用细胞毒种制备的疫苗安全性良好,疫苗免疫效价与豚鼠脑毒种疫苗无明显差异。