菌种操作规程

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1、系统名称SYSTEM: 操作规程主 题 SUBJECT:菌种操作规程文件编号DOCUMENT NOo :RU-F-O18PAGE1/9evoAOX派 修订履历 X XREVcTCN NOo日期修订内容备注AOXXXX-XX-XX初版发行编制宙核批准系统名称SYSTEM: 操作规程主 题 SUBJECT:菌种操作规程文件编号DOCUMENT NOo :RU-F-O18PAGE2/9evoAO1目的建立微生物学检定用菌种的管理制度，规范检定用菌种的接种、保存、传代方法及要求，最 大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。2范围本规程合用于实验室检定用菌种的管理

2、。3参考文件3.1 中国药典2022年版3.2 中国药品检验标准操作规范2022年版4定义4.1 标准菌株：由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。4.2 传代用菌种：是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制 备工作用菌种。4.3 工作用菌种:是指用购入的菌种或者传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作 使用的菌种。4.4 菌种的传代:是指将其接种至一新鲜培养基上或者培养基内，每萌发一次即称为一代。从菌 种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。5职责5.1 质管部主管负责监督本规程的运行。5.2 微生物检验员负责执行本规程的操作。6

3、程序6.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出购买申请，经审批后购买冻干菌种（标准菌株）或者传 代用菌种。购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代的代数。6.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时 将菌种的所有信息，填写在菌种购买传代销毁记录上，内容包括：名称、批号、代数、来源、 接收日期、接收人等，并将其暂贮存于28冰箱中。6. 3菌种的保存6. 3.1工作用菌种的保存系统名称SYSTEM: 操作规程主 题 SUBJECT:菌种操作规程文件编号DOCUMENT NOo :RU-F-O18PAGE3/9evoAO通常，工作用菌种采用斜面

4、低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长 充分以后，转移至48冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污 染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。生抱梭菌可用1015l硫乙醇酸盐液体培养基培养后，注入液体石蜡保存。保存时间根据菌种的种类而不同，通常48冰箱中保存每12月转种一次。6. 3.2传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或者液体石蜡保存法。6. 3. 2. 1甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或者琼脂斜面的菌苔，通过接种环与 试管壁之间的轻轻磨擦而使细菌充分扩散到预先装入的约ImI无菌纯化水中，再加入等体积的无

5、菌 甘油溶液(40%),轻轻振摇，使内容物充分混合，即为20%甘油菌悬液。每一个菌种制备若干支 按顺序进行编号，在-25-30C冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代(G2)。可以每隔2年 转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或者接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传 代或者工作用。此种方法主要合用于需氧细菌和酵母菌的保藏(如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌)6. 3. 2. 2液体石蜡保存法D无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加棉塞，用牛皮纸包 好,在121灭菌30分钟,置40C恒温箱中蒸发水分后备用。2)液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件

6、下培养结束后， 在层流台下用以无菌技术向复壮后的菌种菌悬液中广2ml管加石蜡高出菌种表面约 Icm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，制备若干支，按顺序进行编号， 置于-20冷冻或者28C冰箱中保存。此法主要合用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽胞 杆菌的保存(如枯草芽花杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等)。6. 3. 2.3冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种编号、制备日期、贮存条件、有效期等。6. 3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见下表Io表1传代用菌;中保存方法、保存温/式保存期限困种名称保存方法保存温度保存期限大肠埃布菌(CMCC(B) 44102 J金黄色彷萄球菌ICMee(B) 26

7、003J2彳匕枯草芽抱杆菌(CMCC(B)63501 )铜绿假单胞菌(CMCC (B) 10104)系统名称SYSTEM: 操作规程主 题 SUBJECT:菌种操作规程文件编号DOCUMENT NOo : RU-F-018PAGE4/9ReVoAO白色念珠菌（CMCC（F）98001）加什HAttE1缶黑曲霉菌（CMCC （F） 98003液体石蛤目2 8C1年生抱梭菌（CMCC（B）64941）:可用硫乙醇酸盐液体培养基培养后，取0.5ml菌液，再加 入0.5ml40%无菌甘油于冷冻管内，-25、-30保存2年。6.4菌种的处理和保藏6. 4.1标准菌株的复苏、确认、传代6. 4. 1. 1

8、标准菌株的复苏6. 4. 1. 1.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75骄酉精及棉球等。7. 4. 1. 1. 2培养基D营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌复 苏、复壮；2）硫乙醇酸盐液体培养基：用于生抱梭菌复苏、复壮；3）改良马丁培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；4）改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮。注：培养基也可采用菌种说明书推荐的种类。6.4. 1.1. 3标准菌株的复苏操作步骤：（以下操作均在生物安全柜内进行）D用75%酒精棉球对菌种瓶进行擦拭消毒，自然待干。2）在无菌操作条件下，按说明书的方法打开存放菌种的西林瓶或者安甑管。3）以

9、无菌方法用一无菌吸管从已准备好的复苏液移取0.50.8ml到菌种瓶中。 复苏液采用菌种包装所附带提供的或者菌种说明书推荐的种类。4）轻轻地旋转菌种瓶以使冻干菌种和复苏液充分混合并彻底溶解。5）用无菌吸管将菌种瓶内菌液全部转接到相应的液体培养基。6）根据不同菌种类型而将其培养于相应的温度。细菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、生抱梭菌等）培养温度3035C,培养1824小时；真 菌（白色念珠菌、黑曲霉菌等）培养温度2328C,培养35天。观察是否浑浊，浑 浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。7）若黑曲

10、霉为菌悬液，则先放置室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体12滴滴在 改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置2328C培养57天，斜面正面为黑褐色系统名称SYSTEM: 操作规程主 题 SUBJECT:菌种操作规程文件编号DOCUMENT NOo :RU-F-O18PAGE5/9evoAO厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05% （mlnl）的聚山梨酯-80的0. 9*无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。8）取经复苏后的上述细菌菌液810ml至液体培养基中按6）项操作对菌种进行复壮。黑 曲霉按7）项下方法进行复壮，制成复壮后的抱子悬液20mlo6

11、. 4.1.2标准菌株的确认1）用无菌接种环取上述培养物接种到胰酪大豆陈琼脂（TSA）培养基（细菌）或者沙氏葡 萄糖琼脂培养基（真菌和酵母菌）平板上，或者相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板 上。2）然后在3035C下培养3天（细菌）；2025C下培养5天（真菌和酵母菌）。3）培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划 线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便采集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保 存和鉴定。4）鉴定时观察其染色特性及形态特征，必要时作革兰氏染色、镜检，或者再做生化实验以 进一步鉴定该菌种。5）若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或者菌

12、种不纯，应将此被污染了 的培养物灭活处理，并寻觅原因。应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。6. 4. 1. 3菌种的传代6. 4. 1.3.1标准菌株的传代D按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基内，称第1代（Gl ）,复壮后转接 至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。2）菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管或者液体石蜡管，作 为保存菌种（G2）,也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌 种，此为第3代（W3）。3）将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于 日常

13、检验。4）取一支冷冻保存的第2代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上。平板上的菌种可依据 需要制成冷冻保存管第3代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作 工作用菌种，此仍为第3代（W3）。5）将第3代黄种（一冷冻或者低温保存T生生转种后的第2代TG眇菌种经高温夹活处理后丢弃。系统名称SYSTEM: 操作规程主 题 SUBJECT:菌种操作规程文件编号DOCUMENT NOo :RU-F-O18PAGE6/9evoAO6）按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作, 保存和使用菌种。7）当工作用菌种代数小于5时，在规定保存期限内，可直接用上一

14、代工作用菌种转接下一 代工作用菌种。6.4 . 1.3.2传代用菌的传代当无标准用菌种时，可从省（市）药检所购买菌种作为传代用菌种，不需经过复溶增菌，但 应划线接种确认。将购回无异常的传代用菌种（普通为第3代），根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转 接斜面菌种数支，作为工作用菌种（为第4代），同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯 菌落制成浓菌悬液按“ 6.3.2”的方法制备甘油冷冻管或者液体石蜡管数支，作为传代用菌种（仍 为第3代）。6.5 .1.3.3工作用菌种的传代当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱48保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌 种，作为工作用菌种。也可取用“甘油冷冻管保藏法或者液体石蜡覆盖保藏法”保存的菌种，进 行复苏，直接作为工作用菌种。当超过5代，须用传代用菌种传代。6. 4. 2注意事项传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。同时实验人员也要采取有效的预防 措施进行自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消