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1、. . 实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以与无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30孵育10分钟后，于4下12000rpm 离心10分钟
2、。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4下7000rpm离心5分钟。 RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80待用。2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和28
3、0nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 g RNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为：A260 稀释倍数 40 g/ml。具体计算如下：RNA溶于40 l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/l 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 l，剩余RNA总量为：35 l 0.84 g/l = 29.4 g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电
4、泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60，10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS电泳缓冲液浓度成分 0.4MMOPS，pH 7.00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽，加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。56V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2
5、3cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2l2上游引物0.2l3
6、下游引物0.2l4dNTP0.1l5逆转录酶MMLV0.5l6DEPC水5l7RNA模版2l8总体积10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管外温度一致，然后加逆转录酶0.5l，37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。4梯度稀释的标准品与待测样品的管家基因（-actin）实时定量PCR -actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3l按10倍稀释（加水27l并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、10
7、4，以备用。反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料10l2阳性模板上游引物F0.5l3阳性模板下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6阳性模板DNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10l2参照上游引物F0.5l3参照下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6待测样品cDNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后
8、93 1分钟，55 2分钟，共40个循环。5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量110 PCR缓冲液2.5 ul2MgCl2 溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（941分钟；551分钟；721分钟）； 72C延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性
9、扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为11010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量PCR 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料 10 ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP 1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O 30ul8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条
10、件为：932分钟预变性，然后按93 1分钟，551分钟，721分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，
11、100mg肺提取RNA 200ng，脑的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。反转录反应 反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。反转录反应条件如下。 37C 15 min（反转录反应） 85C 5 sec（反转录酶的失活反应） Real Time PCR反应 选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为参。基因引物序列扩增片段长度NR2BNR2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bpNR2B()ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s rRN
12、A18s rRNA(+)TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198 bp18s rRNA()CGTTTATGGTCGGAACTACGA1） 按以下组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 终浓度 SYBRPremix Ex TaqTM（2） 12.5 l1PCR Forward Primer（10 M） 1 l0.4 MPCR Reverse Primer（10 M） 1 l0.4 M模板（cDNA溶液） 0.5 ldH2O 10 lTotal 25 l 全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用
13、相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 l。2）三步法PCR 首先95C 作用3 min。 PCR进行35个循环。步骤温度时间变性95C30 秒退火58C30 秒延伸72C30 秒融解曲线温度时间变温速度95C0秒20C/秒55C15秒20C/秒95C0秒0.1C/秒PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1将PCR反应的试管与反应板紧贴。2当酶反应混合物以70“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因
14、素，必须与其它成份保持平衡。5对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：1在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。3检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。4检查模板和引物的用量。5增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：1减少循环次数或模板DNA的用量。2提高退火温度，但不要超过68。
