免疫组化方法（冰冻切片）A・所需溶液和试剂1.二甲苯2- 无水乙醇（100%和95%，变性无水乙醇，组织学级）3- 苏木精（可选）4- 固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂a. 10%中性福尔马林b. 丙酮c. 甲醇d. 3%甲醛溶液:配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS 中5- 10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g三羟甲基氨基甲烷（Tr izmabase，C4H11NO3）和80 g氯化钠（NaCI）用浓盐酸将pH调节到7.66- 漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L7- 甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中保存在-20°C8- 封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清9- 配制时，将500 pl山羊血清和30 pl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中10- 检测系统：根据厂家说明书使用已有的检测系统*11- DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。
B・ 切片1- 对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右这可以避免切片时样品断裂2- 将样品切成大约6-8 pm厚，铺在带正电性的玻片上3- 固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟这有助于切片贴紧玻片）C. 固定注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂1-玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定a. 10%中性福尔马林：室温10分钟立即进行染色操作b. 冰丙酮：-20°C 10分钟立即进行染色操作c. 甲醇：-20°C 10分钟立即进行染色操作d. 3%甲醛溶液：室温15分钟立即进行染色操作e. 3%甲醛/甲醇：先在室温下3%甲醛中固定15分钟，然后在-20°C的甲醇中固定5分钟（中间不漂洗）立即进行染色操作D. 染色1- 切片用漂洗液洗两次，每次5分钟2- 室温下，浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟3- 用漂洗液洗两次，每次5分钟4- 在切片上滴加封闭液，室温封闭1小时5- 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中6- 去掉切片上的封闭液，每个切片上加100-400 pl稀释的一抗4°C孵育过夜7- 去掉抗体用漂洗液洗3次，每次5分钟。
8- 根据厂家说明书，用合适的检测系统*检测9- 用漂洗液洗3次，每次5分钟10- 加入100-400 pl DAB或合适的底物，近距离检测染色进展11- 一旦切片染色成功，立刻将玻片浸入水中12- 如有需要，将切片泡在苏木精溶液中复染，按照产品说明进行13- 切片用蒸馏水洗两次，每次5分钟14- 切片脱水：a. 在95%乙醇中孵育两次，每次10秒b. 在100%乙醇中孵育两次，每次10秒c. 在二甲苯中孵育两次，每次10秒15- 加上盖玻片。