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1、3500基因测序仪操作流程一、启动仪器1按下仪器的电源键，当仪器指示灯为绿色时表明仪器正常开启。2打开与仪器连接的计算机，点击Ctrl+Alt+Delete界面，点击Administrator，输入密码：Administrator。等待Daemon（隐藏图标），Server Monitor程序完全启动，Server Monitor图标上出现绿色对号时表示连接成功。3打开3500 Data Collection 软件，出现 3500 Log In 登录界面，输入用户名和密码，本机用户名为：Administrator，密码为：Administrator1，点击“OK”，打开软件。检查所有耗材的剩余
2、用量、仪器的信息、耗材的使用信息以及仪器维护提示灯信息。4. 确认检测阴性、阳极缓冲液在刻度线以上，以及确认所有耗材已恢复至室温。注：3500测序所用到的阳极缓冲液、阴极缓冲液在仪器上可存放一周，POP胶在仪器上存放一周后需置于2-8保存，洗液为一次性消耗品，不可重复使用。5. 将阴性缓冲液、阳极缓冲液、洗液等耗材安装至仪器上后，点击refresh，确认所有耗材均为有效状态。二、仪器维护1. 于软件主界面点击Dashbord，于菜单栏中选择Maintenance Wizards选项。2. 将装有阳极缓冲液的耗材从仪器中取下，安装没有阳极缓冲液的容器，选择WASH pumper chamber
3、and chanels选项，按照仪器指示，开始清洗管路并重新给毛细管灌胶直至完成全部操作。3. 从Maintenance进入Spatial界面，按图示指示进行空间定位。结果应满足如下要求：峰高大致相同（大于6000）；峰型尖锐，左右堆成；橙色十字在峰顶端；峰间距为13-16。当结果满足要求时，选择“Accept Results”，否则，选择“Reject Results”，重新进行空间定位。4. 从Maintenance进入Spectral界面，按图示指示进行光谱校准。本仪器为8道毛细管，光谱校准品加样的位置为A1-H1，校准结果允许借用周边1道毛细管的结果；光谱校准通过显示绿色，借用信息为黄
4、色箭头，失败为红色。校准成功选择“Accept”，否则，选择“Reject”，重新进行光谱校准。三、检测运行1. 测序PCR（以BigDye Terminator v3.1试剂盒为例），标准质粒和样品推荐测序反应体系及反应条件如下：标准质粒测序反应体系：引物4 L，Big dye 1 L，BigDye Seq Buffer 3.5L，超纯水10.5 L，模板1 L。样品测序反应体系：引物（10 M）0.5 L，Big dye 1 L，BigDye Seq Buffer 3.5L，超纯水14 L，模板1 L。测序反应条件为：96 1 min (96 10 sec 50 5 sec 60 4 mi
5、n)25个循环 4 保温2. 测序产物纯化（以CENTRI-SEP spin-columns纯化柱为例介绍） 于纯化柱中加入800 L的无RNase超纯水，颠倒混匀，室温静置30 min。 上下颠倒除尽气泡，去掉纯化柱底部的盖子，置于2 mL洗脱管中，在将纯化柱上部的盖子打开后，盖上盖子，压入空气，柱中的液体自动流入洗脱管中直至自行终止，最后洗脱管中的液体大约为200-250 L，弃掉滤液。 750g离心2 min去除多余液体，离心完毕后洗脱管中约有300 L液体。 将纯化柱转移至1.5 mL的样品收集管中，从柱的斜面上缓缓加入20 L的PCR测序产物。 750g离心2 min，取滤液备用，静
6、止重复离心。 3. 测序产物加样 于待检测孔中加入10 L的Hi-Di甲酰胺后，再次加入10 L纯化后测序产物，混匀，尽量避免气泡产生，不加样的空中加入10 L的超纯水。 于96孔板上安装胶垫，按照顺序组装到自动进样器上。4. 数据收集软件运行点击Start pre-heat预热30 min，POP7和POP4的胶预热到60 ，POP6的胶预热到50 ，预热后检查detection cell的温度。通过Main workflow键进入Set up视窗，选择Define Plate Properties界面建立新的样品反应板，在Name栏输入样品板的名称，板子类型：96孔板，毛细管长度：50 c
7、m，胶以及测序类型根据需要选定。输入样本名称，选择相应的 Assays，File Name Conventions，Results Groups。切换到Load Plates for Run视图，从Recent Plates找到要电泳的反应板，点击Link Plate（灰色表示反应板连接上，黑色则表示没有连接上），点击Start Run进行电泳。切换到 Monitor Run 视图，通过 Assay，Sample，EPT界面查看样品的电泳情况；通过 Flags Found 界面借助软件可直接判断样品的结果是否满足质量要求，红色旗帜表示不满足质量要求，绿色旗帜表示满足质量要求。 进入Review
8、 Results视窗，点击View Fragment/HID Results 查看样品的电泳结果。如 Offscale（峰过高，导致渗透峰产生），Board Peak（宽峰）等要素的图标为绿色方块 ，Sizing Quality（内标的质量）为带对号的绿色方块，则表示满足质量要求；如Offscale，Board Peak 的图标为黄色三角形，Sizing Quality为带X的红色方块，则表示不满足质量要求，可以通过Plot View和Sizing Table View 等界面分别查看样品的电泳图谱和内标的情况。5. 测序结果分析 点击sequence analysis V5.4软件，输入用户
9、名DangDongCIQ，输入密码123456，打开软件。点击File，选择Add sample，选择所需分析测序文件。点击绿色三角形图标进行测序结果分析。测序峰图的荧光信号强度正常范围为1000-3000，且峰间距明显，测序结果质量分数较高，可视为本次测序基本成功。6. 常见问题及解决措施（1）信号值太高样品浓度过高，应稀释样本浓度，降低进样时间。反应体系中DNA加入过量。（2）无信号值 测序反应失败。毛细管堵塞，重新灌胶。毛细管阵列弯曲，应重新更换毛细管阵列。毛细管破裂或损坏（3）低信号值甲酰胺降解，更换新的Hi-Di甲酰胺。样本量不足，增加DNA的量。样本中盐浓度过高，采用蒸馏水或去离子
10、水对样本进行稀释或采用去盐的纯化柱继续样本纯化。测序样本未充分混匀。DNA扩增效率低，重新扩增DNA或检查DNA质量。自动进样器超出校准范围。检查样本体积，如果信号任然很低，联系ABI技术顾问。（4）过高的基线管路中的胶可能存在污染，可采用conditional reagent清洗胶泵。胶中可能存在污染或晶体沉淀，将胶恢复至室温使用，如果胶已过期可更换新胶使用。弱的光谱校准，重新进行光谱校准。（5）分辨率低进样量过多。低质量的水。POP胶已降解。毛细管阵列的进样次数超过160次。降解的甲酰胺。样品中盐浓度过高。7. 关闭仪器先将数据收集软件和测序软件等程序关闭后，关闭仪器的电源，随后关闭计算机。
