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1、 人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的探讨 人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的探讨 作者： 王振显蔡文清庞国勋宋永周陈康宁孙福振杨涛 【摘要】目的探讨人脱细胞羊膜（Humanacellularamnioticmembrane， HAAM） 负载大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 进行膀胱替代修复的可能性。 方法用去污剂洗涤和酶消化方法制备 HAAM。 将大鼠 MSCs 在体外培育、 扩增、 传代。 取第 4 代干细胞用 1%二甲亚砜（DMSO） 预诱导 8h， 然后应用膀胱匀浆上清液诱导7d。 将诱导分化后的 MSCs 接种于 HAAM 表面进行短暂体外培育
2、， 获得组织工程膀胱。 将雄性大鼠 60 只随机分为 3 组， 行半膀胱切除术， 然后分别接受负载干细胞后的 HAAM（A 组）、 HAAM（B 组） 以及单纯缝合（C 组） 的方法进行修补， 每组 20 只。 分别于术后 2、 4、 8w 测定膀胱容量、 进行膀胱造影并取材视察组织再生状况。 结果去污剂洗涤联合酶消化法能有效去除人羊膜中的细胞成分， 光镜及电镜视察无细胞成分残留， 细胞相容性好。 大鼠膀胱重建术后， A、 B 两组与 C 组膀胱最大容量(Volmax) 比较有极显著性差异（P0. 01）， 而 A、 B 两组之间膀胱最大容量比较无显著性差异（P0. 05）。 组织学视察， 2
3、w 时 HAAM即已吸取降解， 膀胱移行细胞和平滑肌细胞起先形成， A 组吻合修补区较厚， 平滑肌细胞规则且丰富。 结论 HAAM 作为膀胱移植物进行膀胱修补吸取降解快速， 负载 MSCs 后构建的组织工程膀胱是志向的替代修补材料。 【关键词】 膀胱； 移植； 脱细胞羊膜； 生物医学工程 最 早 应 用 组 织 工 程 学 原 理 进 行 组 织 工 程 膀 胱 构 建 的 是Wakeforest 高校医学院再生医学探讨所的 Atala 等人， 他们于 1998年进行了同种异体狗再造膀胱的试验探讨1。 目前组织工程学技术的探讨主要集中在二个方面： 支架材料的探讨与开发； 种子细胞的培育和植入受
4、损的组织， 使其功能得到复原。 膀胱无细胞基质和小肠黏膜下层是目前报道最多的组织工程膀胱支架材料。 羊膜是一种自然高分子生物材料， 来源广泛， 不违反伦理。 本探讨接受化学去污剂和酶消化的方法去除簇新羊膜中的细胞成分， 保留细胞外基质， 制备人脱细胞羊膜 （HAAM）作为支架材料， 并以大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞构建了组织工程膀胱， 探讨异种来源的 HAAM 作为生物支架材料构建组织工程膀胱的可行性。 1 材料与方法 1. 1 试验材料 46 周龄 100150g 健康清洁级 SD 大鼠 2 只， 8 周龄 220250g大鼠 4 只， 雌雄不限。 8 周龄以上成年健壮雄性 3
5、00500g 大鼠 60 只，由河北医科高校试验动物中心供应。 LDMEM及0. 25%胰蛋白酶 （Sigma 公司）， 胎牛血清（北京元亨圣马公司）、 , PBS 液， 二甲基亚砜（DMSO，美国 Ramp; D 公司）， 1%TritonX 100, 小鼠抗大鼠 平滑肌肌动蛋白一抗， 山羊抗小鼠二抗。 日本 Olympus 荧光倒置显微镜 IX71 和光学显微镜CX31。 SHZ88台式水浴恒温震荡器 （江苏太仓市试验设备厂）。 1. 2 种子细胞培育 1. 2. 1SD 大鼠 MSCs 的分别与原代培育2 46 周龄大鼠 2 只， 无菌取其双侧股骨、胫骨和胸骨， 用 L DMEM培育基冲
6、出骨髓于离心管中， 吹打制成单细胞悬液， 离心后用生长培育基重悬。 将细胞接种于培育瓶中， 37、 5%CO2 环境下常规培育。 1. 2. 2 大鼠膀胱匀浆上清液对 MSCs 的诱导分化 8 周龄大鼠 4 只， 无菌取其膀胱， 立刻用 PBS 液冲洗， 匀浆、 离心， 取上清液用 0. 2 m 的针头滤器过滤。 取第 4 代 MSCs 以 2104/ml密度接种于预置盖玻片的 6 孔培育板中培育 2d， 使细胞贴壁。 吸出培育基， 换入含有 1%DMSO 的培育基预诱导 8h， 然后换入膀胱匀浆上清液与 DMEM 为 1 1 的混合培育基培育 7d。 期间换液 1 次。 1. 2. 3 培育
7、细胞免疫细胞化学染色鉴定及纯度计算 诱导分化的 MSCs 以 平滑肌肌动蛋白（SM actin） 抗体行免疫细胞染色， 以未进行诱导的 MSCs 为阴性比照， 进行同样的染色处理。 光学显微镜下视察， 随机选择 10 个镜野， 计算纯度, 纯度染色细胞数/细胞总数， 取平均值。 1. 3HAAM 制备 1. 3. 1 羊膜的选材 严格遵循供体医学标准。 在获得健康胎盘后， PBS 液反复冲洗，钝性分别羊膜与绒毛膜组织， 去除羊膜基底面残存的绒毛膜和血管组织， 浸泡于以 0. 01mol/LPBS 液稀释的 1%TritonX 100 中， 反复震荡摇摆 24h， 然后置入 1%胰蛋白酶中再震荡
8、摇摆 4h 取出， PBS 冲洗。 制备好的单层羊膜为白 色半透亮的薄膜， 有确定弹性及韧性， 厚约0. 1mm。 由于其较薄， 缺乏确定的张力， 尚不能用于手术修补。 将 68 片处理好的单层羊膜按彼此纤维方向垂直的位置重叠， 以 200W 的可见光照射 3h， 从而使其交联成 0. 60. 8mm 的较厚补片， 张力大大增加， 能耐受缝合牵拉的力气。 以钴 60 射线照射 20min 消毒（20kGy）后备用。 1. 3. 2HAAM 细胞毒性测定 依据文献3 要求制备 HAAM 浸提液； 取诱导分化的 MSCs 按 1104 细胞/孔接种于 96 孔板， 正常培育基组为比照组， 浸提液组
9、为试验组； MTT 法测定吸光度 A 值， 计算细胞相对增殖率（RGR） , RGR试验组 A 值/比照组 A 值， 并对材料毒性评分4。 1. 4 组织工程膀胱的构建 1. 4. 1MSCs 接种 诱导分化后的 MSCs 以 2104/ml 密度接种于预置 2cm2cmHAAM的 6 孔培育板中后加培育基 2ml。 置 37、 5%CO2 培育箱内， 在饱和湿度条件下复合培育。 1. 4. 2MSCs/HAAM 复合物显微镜检查 收获培育 36h 的 MSCs/HAAM 复合物， HE 染色光镜及扫描电镜检查。 1. 5 大鼠膀胱修复重建试验 1. 5. 1 大鼠膀胱重建 将 60 只兔随机
10、分为 3 组， 每组 20 只。 麻醉后取下腹部正中切口，显露膀胱， 游离膀胱四周组织， 行半膀胱切除术， 以婴幼儿输液器作为导尿管顺行置入， 尿道外口处 4 号丝线妥当缝合固定尿管。 A 组以MSCs/HAAM 复合物补片用 5 0 可吸取线缝合于膀胱缺损处， B 组以单纯 HAAM 补片修补膀胱， C 组不运用任何材料干脆缝合。 经尿管注水检查无漏尿。 A、 B 两组以 1 0 丝线在吻合口前、 后、 左、 右（浆膜面，避开穿透） 各缝 1 针作为标记。 C 组吻合口上下端以 1 0 丝线缝合 2针作为标记。 尿管于术后 7d 拔出。 全部动物术后均肌肉注射青霉素抗感染 3d。 1. 5.
11、 2 术后膀胱检测 分别于术后 2、 4、 8w 时， 每组取 5 只动物处死。 处死前测定膀胱最大容积(Volmax) 。 方法是将膀胱排空， 用注射器经细尿管（婴幼儿输液器） 向膀胱注入生理盐水， 尿道外口有尿液滴出时注入的水量即为 Volmax。 解剖视察膀胱大体形态， 并依据标记线取材固定， HE 染色后光镜下视察组织学变更。 第 8 周时各组动物进行膀胱造影后再进行前述处理。 1. 6 统计学方法 数据接受 xs 表示, 组间比较接受 t 检验。 2 结果 2. 1 种子细胞培育 原代培育的骨髓细胞成分困难, 形态不规则。 79d 细胞长满瓶底， 主要呈纺锤形细胞。 诱导分化 7d
12、后 MSCs 转变为梭形平滑肌样的细胞， 融合后形成峰谷排列， 部分细胞表现为 SM actin 染色阳性， 胞浆呈现棕黄色。 随机计数 10 个视野计算诱导分化率为（45. 63. 5） %。 未进行诱导的 MSCs 亦有少量细胞 SM actin 染色阳性（3. 80. 77） %。 2. 2HAAM 检测 将经物理和酶处理的 HAAM 做 HE 染色， 置光学显微镜下视察， 可见大量浅红色胶原纤维未受损， 无蓝染核物质， 表面没有残留的细胞碎屑。 扫描电镜下 HAAM 表面粗糙， 一面为网状纤维结构， 孔隙较多，大小不一。 两面均无细胞残留(图 1) 。 HAAM 浸提液组细胞平均相对增
13、殖率为 88%， 毒性评分为 级（表 1）， 证明所制备的 HAAM 组织相容性好， 符合生物材料应用要求。 表 1 细胞相对增殖率和细胞毒性分级(略) 2. 3 组织工程膀胱构建 复合培育 36h 后 HE 染色视察可见 HAAM 材料上生长的细胞， 部分融入支架材料内； 扫描电镜下可见 MSCs 生长良好， 且有突起伸出固定于四周支架材料（图 1）。 2. 4 大鼠重建膀胱的大体视察及容量测定 A、 B、 C 三组术后 1w 内分别死亡 5 只、 4 只和 1 只， 均死于尿外渗和膀胱四周感染。 另外 A、 B 两组均有一只动物有明显尿外渗（腹腔肿大）， 但未死亡， 后尿外渗慢慢好转。 术
14、后 2w 时重建膀胱被大网膜包绕， 细致分别后可见标记线内膀胱已愈合良好， 但较薄， 不能辨别出 HAAM。 4、 8w 时仍可见局部黏连， A、 B 两组膀胱已达正常膀胱外观，C 组膀胱明显缩小， 局部黏连比 A、 B 两组略微。 2w 时 A 组大鼠膀胱的Volmax 为(1. 210. 60) ml， B 组为(1. 120. 53) ml， 两组比较无统计学意义（P0. 05）， C 组(0. 750. 41) ml, 与 A、 B 两组比较均有显著差别(P0. 05) 。 随时间延长， 4、 8w 时大鼠的膀胱容量略有增加但两组仍无差别。 8w 时膀胱造影见 A、 B 两组重建的膀胱与正常膀胱相像，C 组膀胱明显缩小（表 2、 图 2）。 2. 5 重建膀胱的组织学视察 A 组和 B 组术后 2w 时 HAAM 修复区已有上皮细胞和膀胱平滑肌细 胞形成， 但 B 组平滑肌和上皮层较薄， 平滑肌不规则， A 组则上皮层和平滑肌略厚， 相对规则。 两组均有嗜酸细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润（图 3）； 4 和 8w 时两组已经与正常膀胱组织无明显区分。 C 组 2w时切口区仅略微炎性细胞浸润， 无其他异样。 表 2 手术各组术后不同时间 Volmax 的测定结果（略） 3 探讨 组织工程学是近年来新兴起的一门学科， 受到了科学界的广泛关注。 其核心是利用组织
