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1、实验室常用细胞表征及处理方法一、细胞培养1.1 细胞培养基配方普通细胞所需要的培养基配方主要为：购买的培养基 +10 %血清（小牛或者胎牛）+1% 双抗。（常用的双抗及胰酶建议直接购买）1.2 细胞传代121洗涤：将培养瓶内的旧培养液吸出，加入23ml PBS缓冲液洗涤2-3 次，摇晃使其均匀铺满整个平面，清洗细胞，随后吸弃PBS液以除去残留的血清 和死细胞。122消化：加入适量（盖满细胞层表面即可，25cm2的培养瓶加入0.5-0.6mL 即可，75 cm2加入l.OmL）的0.25%胰蛋白酶液，轻轻摇晃，普通细胞一般需要 60s左右，特别难以消化的细胞可以放在37C孵箱孵育适当的时间，如H
2、ela细 胞大约需要30s-40s,翻转培养瓶。然后在倒置相差显微镜下观察细胞消化情况, 待细胞开始收缩成圆形、细胞间的连接明显消失，细胞间出现明显的空隙,即可 终止消化（若细胞成片收缩，倒去消化液）。若存在细胞团，可以轻轻拍打培养 瓶侧壁，尽量消化完全，不然传代后会出现较多的细胞团，再次消化会非常困难。1.2.3终止消化:在培养瓶中加入1-3ml培养液（胰酶遇血清会终止其活性） 以终止消化。用吸管反复吹打洗瓶壁上的细胞，边角部分特别注意多次吹打。可 在倒置相差显微镜下观察细胞吹打的程度，（轻轻摇动培养瓶，观察细胞是否完 全脱壁），最后形成单细胞悬浮液。将单细胞悬液移入15ml离心管内，离心1
3、000rX5min，弃去上清液，加入5ml 培养基进行吹打重悬（也可不用离心，直接把单细胞悬液分装于新的培养瓶里， 补加适量培养基）。小培养瓶需5ml左右培养基，直径60mm培养皿5-7ml，以上 均应视细胞的数目而定，细胞多，可适当加多些培养基）。124 传代：取上述步骤所得单细胞悬液，进行细胞悬液计数，然后按所需 密度接种到其它培养瓶中。标注上代数、日期及操作人。注：本实验所需的PBS液、DMEM细胞培养液及0.25%胰蛋白酶液均需37C预热 处理。1.3 细胞冻存1.3.1 消化：若细胞生长状态良好，则在冻存前一天弃去旧培养液，更 换新鲜培养液，并加入适量 0.25%胰蛋白酶液，消化细胞
4、。1.3.2. 计数：加入 25ml 培养基，终止消化。吹打细胞制成单细胞悬液， 利用细胞计数板计数。并将吹打分散的单细胞悬液转移至无菌离心管，离心 1000rX5min，弃去上清液。1.3.3 转移：根据细胞计数结果调整加入的培养基体积，使细胞浓度约 为1-2X 106/ml，吹打进行细胞重悬。吸取1ml该细胞悬浮液转移至2ml细 胞冻存管中，并补加50 m l DMSO （终浓度约为5%），并在管上标注细胞株名 称、代数、密度、冻存日期、冻存人等信息。1.3.4 冻存盒：将室温放置的冻存盒内内置管架取出，并加入 250ml 异 丙醇，放回内置管架。冻存盒反复使用 5 次后更换异丙醇。直接将
5、细胞冻存 管放入冻存盒保存于-80 C冰箱。81孔板:直接使用81孔板进行冻存需要进行梯度降温，即4C保存1h, 转入-20C保存4h,最后转入-70C短期冻存或者转移至液氮进行长期冻存。（在深低温（零下200度）保存细胞的冻存过程中，为防止细胞内液冰 晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，有必要使用含有 DMSO 冷冻保护剂。 DMSO 能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过 程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。 深低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。但复苏时动作要快，尽快洗掉二 甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。二甲基亚砜（DMSO）
6、是目前最好 的细胞冻存保护剂，但也是一种细胞毒性很大的化学试验剂。研究结果表明， 培养液中DMSO浓度为10%时，细胞生长抑制率近100%； 1%。浓度时抑制率为 35%,即使是0.04%。的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响。）1.4 细胞复苏1.41.解冻：迅速将保存于液氮或者-80C的冷冻管取出，投入3740C 的温水水浴，充分摇动，使其迅速融化。1.4.2清洗：融化后迅速转移至超净工作台，取离心管并加入3-5ml培 养基，迅速将细胞悬浮液转移至离心管以稀释DMSO的浓度，1000r/min离心5min，弃去上清液，加入4-5ml培养基（以复苏的细胞数量估计），轻轻吹 打悬浮细胞使
7、其分散均匀。1.4.3. 培养:将细胞悬浮液转移至新的培养皿内，置于37C孵箱内培养。 第二天观察后换液。二、细胞活性检测为了能够更好的延续细胞的活性，减少细胞损伤，本研究采用Alamar Blue （AB）试剂 进行表征，这种方法的独特优点在表征后的细胞可以继续培养。具体的操作步骤如下:2.1材料与细胞培养一定时间的时间后，将旧培养基吸去，加入一定量的PBS （配方见 附录）清洗 2-3 次。2.2 将培养基与 AB 溶液按照 10:1（9:1）的比例配置一定体积的工作液。2.3在实验组，对照组和空白组中加入等量的工作液，然后盖上锡箔纸避光，放入37C 孵箱孵育4 个小时。2.4将孵育后的工
8、作液（200 “ L）分别加入到96孔板中，使用酶标仪在波长570和600nm 处测试其吸光度值，然后按照相应的公式计算其活性（计算公式建附录）。2.5将孔板中多余的工作液吸出，然后加入PBS清洗3-5次，然后加入新的培养基继续 培养。三、细胞铺展测试（SEM）细胞在材料上的铺展情况可以通过 SEM 进行表征， SEM 的样品处理步骤 如下:3.1将细胞与材料共同培养一定时间后，吸取培养基，PBS清洗3次，然后 用 2.5% 戊二醛进行固定（配方见附录）。加入的戊二醛盖过材料即可，然后在 37C条件下孵育20-30min。3.2 吸取上步的戊二醛，加入 30 %， 50 %， 70 %， 80
9、 %， 90 %， 100 %的乙 醇进行梯度脱水。每次脱水时间间隔 15-20 min。3.3然后将其进行冷冻干燥或者37 C条件下缓慢干燥，然后储存在37C， 干燥条件下，进行保存。（电压不宜过高一般为8或者10KV）。3.4喷金，SEM扫描，常采用X250.X500.X 1000倍数进行观察。四、细胞活死染色通过荧光显微镜观察细胞的活性和形态也是细胞实验中常见的表征方法，目前常用的荧光染料为Calcein-AM和PI。具体步骤如下：4.1 染色储备液的配置AM 储备液配置：将 1 mg Calcein-AM 粉末加入 1 mL 无水 DMSO 中，配制 成1 mM的Calcein-AM储
10、备液，-20 C避光保存；用前溶解，取 10卩L Calcein-AM储备液至5 mL PBS中配置染色液（Calcein-AM的终浓度为2卩 M）。PI储备液配置：用1 ml UP水溶解1 mg PI,制备成1.5 mmol/l的PI储备 液（1 mg PI/1 ml H20）, -20C下密闭冷冻保存。染色液终浓度Calcein-AM: 22M mol/l, , PI: 4卩mol/l （可以分别取10L AM储备液和15L PI储备液，然后加入 5ml PBS 或者生理盐水。其他等比例计算）注意： PI 致癌，注意防护措施。4.2 染色步骤4.2.1将各组特定时间节点的细胞用PBS清洗2
11、-3次，加入适量的AM和PI 的混合染色液，在细胞培养箱内避光孵育 20-30min。4.2.2 孵育结束后，将染料吸出，用 PBS 清洗染料 2-3 次，将细胞置于荧 光显微镜下观察活死细胞情况。其中，绿色代表活细胞，红色代表死细胞。激发 波长：490 nm （具体介绍见附录）。（小白楼实验室显微镜无需知道波长，钙黄绿素用蓝光激发， PI 用绿光激发即可）5、罗丹明/DAPI细胞形态染色6、Alamar Blue6.1 检测原理阿尔玛蓝（Alamar Blue ）是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸亮度 变化和荧光信号。这是一种安全无毒的染料，可用于细胞活性和细胞增殖的定量 分析以及细
12、胞因子生物测定和体外细胞毒性研究，能有效测定动物、真菌和细菌 细胞的天然代谢活性。Alamar Blue在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还 原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，反映所研究的细胞或微生物对 氧分子的消耗，因而常被用作氧化还原指示剂，以显示被观察细胞和细菌的代谢 活动。这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能 力。在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD 的比值升高，处于还原环境。摄入细胞内的染料被这些代谢中间体及细胞色素类 还原后释放到细胞外并溶于培养基中，使培养基从无荧光的靛青蓝变成有
13、荧光的 粉红色。受损和无活性细胞具有较低的天然代谢活性，因此对应的信号较低。可 以用普通分光光度计或荧光光度计检测，其激发光波长在 530-560 nm 之间，发 射光波长为590 nm。吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。本品可广泛地用于细胞增殖代谢，药物的细胞毒作用的体外测定以及病原微生物 的的快速检测与鉴定。与台盼兰、TTC、MTT、MTS等分析法相比，Alamar Blue 具有更多的优势。 Alamar Blue 采用单一试剂，可以连续、快速地检测细胞的增 生状态。由于Alamar Blue对细胞无毒、无害，不影响细胞的抗体合成与分泌等 活性，因此可以对同一批细胞的增生状态进行连续观
14、察和进一步的实验观察，因 此有操作简便和几乎不干扰细胞正常代谢的特点。6.2 测试步骤1、首先将细胞培养用的培养基与Alamar Blue(AB)配置成工作液，其中培养 基与 AB 体积比例 10:1。2、将培养一定时间的细胞中的培养基吸出。3、将工作液加入各细胞中，工作液浸没材料为准。记得加一个空白对照和阴性 对照。4、加入一定体积的工作液之后，将其用灭菌后的锡箔纸进行包裹避光，然后将 其放入孵箱进行孵育 4-8 小时，或者观察到工作液变为红色。5、将孵育后的工作液取出，取200微升加入96孔板中；剩余的工作液吸出，用PBS 清洗若干次，然后加入新鲜培养基继续培养。6、把96孔板放在酶标仪中
15、进行检测，分别在波长570和600 nm进行检测。 根据检测结果，然后按照如下公式计算细胞的还原率和增值率。Alamar Blue 还原率() = (E600 X OD570) - (E570 X 0D600)/(E570 X OD600 ) -(E600X0D570 ) X100%相对增殖率()=第n天时Alamar Blue还原率/ SA+ MP球1 d时Alamar Blue 还原率 X100%式中E570氧化型Alamar Blue在570 nm波长的消光系数，即80 586；E600氧化型Alamar Blue在600 nm波长的消光系数，即117 216；0D570检测孔在570 nm波长的吸光度值；0D600检测孔在600 nm波长的吸光度值；E570还原型Alamar Blue在570 nm波长的消光系数，即155 677；E600还原型Alamar Blue在600 nm波长的消光系数，即14 652；OD570阴性对照孔在570 nm波长的吸光度值（含10% Alamar Blue的培养 基，无细胞）；OD600阴性对照孔在600 nm波长的吸光度值（含10% Alamar Blue的培养 基，无细胞）。支架的生物学性能表征、支架的前期处理1、将打印后的支架（24*24*5mm）泡在生理盐水中12 h,然后换入新的生理盐水，浸 没支架为止（在 50ml
