分享】MTT法检测细胞存活及生长什么是MTT?MTT 全称为—（4,5—Dimethylthiazol—2—yl）—2,5—diphenyltetrazolium bromide, 汉语化学名为 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑 蓝是一种黄颜色的染料什么是MTT法？又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法其 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的 蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能二甲基亚砜 （DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收 值，可间接反映活细胞数量在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数 成正比该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物 筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等它的特点是灵敏度高、经济 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测这不 仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂 对实验者也有损害MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。
因此，可以称取 MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS ）或无酚红的培养基中，用0.22“m 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4°C避光保存即可在配制和保存的过程中， 容器最好用铝箔纸包住需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细 胞绝对数在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度 最好在0—0.7 范围内MTT 一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在—20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、 锡箔纸包住避光以免分解我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配， 直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不 能再用了MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套•配 成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟 时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用 用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60°C水浴助溶PBS 配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HP04 1.44gKH2P04 0.24g调pH 7.4定容1LMTT法实验步骤（一）贴壁细胞1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入lOOul,铺板使待测细胞调密 度至1000—10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2. 、5%CO2，37°C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的 药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一 天下午铺板，次日上午加药•一般5-7个梯度，每孔100ul,设3-5个复孔.建议设 5个，否则难以反应真实情况3. 、5%CO2，37C孵育16—48小时，倒置显微镜下观察4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT），继续培养4h若药物 与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含 MTT 的培养液5、 终止培养，小心吸去孔内培养液6、 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解 在酶联免疫检测仪OD49Onm处测量各孔的吸光值7、 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的 药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）（二）悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1 X106/ml,按次序将①补足的1640 （无 血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D （有毒性）10ul用培养液稀释lpg/ml, 需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）；③需检测物10ul ；④细胞悬液50ul （即 5X104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对 照（加100卩（储存液100 1640 ）2、 置37°C，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察3、 每孔加入10 ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h悬 浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、 离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜， 置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解在酶联免疫检测仪0D570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值5、 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓 度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔MTT 法检测细胞存活和生长作者：佚名文章来源：丁香园点击数：3520更新时间：2009-9-29 8:10:36 MMTT 全称为 3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-（4, 5-二甲基 噻唑-2）-2， 5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料什么是MTT法？又称 MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶 能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能二 甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反 映活细胞数量在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比该方法已广泛用于一些生物活 性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等它的特点是灵 敏度高、经济缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测这不仅使工作量增加，也 会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml因此，可以称取MTT 0.5 克,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS） 或无酚红的培养基中，用0.22um滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4°C避光保存即可在配制和保存的 过程中，容器最好用铝箔纸包住需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检 测结果的时候，为了保证实验结果的线性， MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内MTT 一般最好现用现配，过滤后4°C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存， 避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解我一般都把MTT粉分装 在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对 不能再用了MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套•配成的MTT需要无菌，MTT对菌 很敏感；往 96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯 关掉.配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60°C水浴助溶PBS 配方：Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调 pH 7.4定容 1LMTT 法实验步骤贴壁细胞：1、 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边 缘孔用无菌PBS填充）2、 、5%CO2, 37C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴 壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔 100ul,设3-5个复孔•建议设5个，否则难以反应真实情况3、 、5%CO2, 37C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4、 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT），继续培养4h若药物与MTT能够反应，可先 离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液5、 终止培养，小心吸去孔内培养液6、 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值7、 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养 液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1x106/ml,按次序将①补足的1640 （无血清）培养基40ul ；② 加Actinomycin D （有毒性）10ul用培养液稀释（储存液100pg/ml,需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）；③ 需检测物10ul；④细胞悬液50ul （即5x104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充） 每板设对照（加100皿1640）2、 置37°C, 5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察3、 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT），继续培养4 h°（悬浮细胞推荐使用WST-1, 培养4 h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值）4、 离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min， 使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值5、 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养 液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔MTT 法检测细胞存活率或抑制率基本 原理 : 基 本原 理 MTT 分 析法 以活细胞代 谢物 还原剂 3-（4,5）-dimethyl thiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础MTT 为黄色化合物，是 一种接受氢离子的染 料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和 细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，生成蓝色的 formazan 结晶， formazan 结晶的生成量仅与 活细胞数目成 正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原）还 原生成的 formazan结晶可用DMSO （分析纯）来溶解利用 酶标仪测定490 nm处的光密度OD 值， 以反映出活细胞数目试剂配制：试剂配制： MTT 溶液： pH=7.4 的 PBS 配制成 5mg/ml 浓度的溶液， 用 避 光保存） MTT 法检测细胞存活率或抑制率详细步骤 1 接种细胞：用含 10％胎/小牛血清得 培养液配成单个细胞悬液，以每孔10 -10个细胞接种到96孔板，每孔体积100-200》l. 2: 培养细胞：同一般培养条件，培养1-2 天（原代细胞不 同，可根据试验目的和要求决定培 养时间，神经元 7-10 35 天，心肌细胞 8-14 天） 。
3 吸去原培养基， 每孔加入以无血清培养基配制的不同浓 度药物（原代细胞例外） 4 培养 24 或 48h 后， 每孔加 MTT 溶液（5mg/ml, pH=7.4用的PBS配制，避光保存）10-20p l.（每孔培养基为100p l，加10p l,每孔培养基为200p 。