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1、 .wd.凝聚胺法穿插配血试验操作规程目的 保证穿插配血试验准确，确保临床输血安全。适用范围XXX医院输血科职责具有专业技术的工作人员主要负责XXX医院输血标本的穿插配血试验，但只对该单份标本负责。相关文件 试剂采购、保存和使用管理程序 设备采购、使用管理程序 消毒与清洁管理程序 标本采集、运输、保存和报废管理程序 紧急用血管理程序相关记录 仪器设备的采购、使用和维护记录 仪器的温度记录 恒温水温箱的换水和消毒记录 消毒液的配置记录 清洁消毒记录 试剂采购、使用记录 标本交接和报废记录 穿插配血记录 紧急用血记录 实验原理 红细胞外表带有大量的负电荷，以防止产生自发性聚集，当红细胞悬浮在电解质
2、中时，阳离子会被红细胞的负电荷所吸引，此时红细胞则被扩散的双层离子云所围绕而形成Zeta电位，Zeta电位决定红细胞之间的排斥作用。凝聚胺技术首先利用低离子溶液LIM降低介质的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，以促进红细胞与血清血浆中的抗体结合。其次参加的凝聚胺Polybrene溶液是一种高价阳离子多聚物、肝素中和剂，溶解后能产生很多正电荷，可以中和红细胞外表带有的负电荷，使红细胞的Zeta电位降低，缩短红细胞之间的距离，使红细胞产生非特异性的凝集。最后参加的悬浮液Resuspending具有中和凝聚胺Polybrene阳离子的作用，使正常的红细胞非特异性凝集散开，试验结果为阴性；但如果红细
3、胞被相应的抗体致敏，则会被凝聚胺凝集而不会散开，试验结果为阳性。仪器器械 玻璃试管、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、穿插配血专用离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。试剂生理盐水、凝聚胺试剂、Anti-human IgG血清，均为有合格证件的正品。试剂保存和稳定性1 凝聚胺试剂须保存在2-25其中阴、阳对照血清应储存在28。在适当储存条件下有效期24个月。2 抗人IgG血清低温冰箱保存。复溶后放24冰箱保存。3 凝聚胺试剂低离子介质溶液LIM：含葡萄糖，乙二胺四醋酸-2钠及稳定剂。凝聚胺溶液Polybrene：含凝聚胺，氯化钠及稳定剂。复悬液Resuspending：含
4、柠檬酸钠，葡萄糖及稳定剂。阳性对照血清：含抗D血清、氯化钠及稳定剂。阴性对照血清：含AB血浆、氯化钠及稳定剂，不含红细胞血型抗体。标本收集与处理1、受检者血清：采集受检者静脉血23ml，经1000r/min离心1分钟或室温静置1小时后取上清。2、25%的受检者红细胞：采集受检者静脉血或末梢血，先用生理盐水洗涤红细胞3次，再根据下表进展红细胞悬液的配制。悬液浓度%压积红细胞滴盐水滴2140(2ml)51 16 (0.8ml)3、以上标本有效期为三天；假设受血者抽取标本后，输用过血液或血液制品，且输用时间超过12 小时的，必须重新采集标本。4、标本出现中度以上溶血者，为不合格标本，不能用于检测。实
5、验方法与步骤 1、分别制备受血者和献血者35%的红细胞悬液取2支使管分别标注为受血者管和献血者管，再分别参加2ml生理盐水，在受血者管参加1滴受血者红细胞，在献血者管参加1滴献血者红细胞，混匀后备用。2、取4支使管，分别标注主侧、次侧、阴性对照和阳性对照：主侧管：先参加2滴受血者血清血浆，再参加1滴献血者25%红细胞悬液；次侧管：先参加2滴献血者血清血浆，再参加1滴受血者25%红细胞悬液；阴性对照管：先参加2滴阴性对照血清，再参加1滴献血者25%红细胞悬液；阳性对照管：先参加2滴阳性对照血清，再参加1滴献血者25%红细胞悬液。3、混匀后各参加LIM溶液0.65ml，轻轻混匀，于室温下静置1分钟
6、。4、再各参加2滴Polybrene溶液，轻轻混匀，于室温下静置15秒。5、用穿插配血专用离心机3400 r/min相当于1000g离心力离心10秒，然后倒掉上清液不要沥干，让管底残留约0.1 ml液体。6、轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做。重做后仍然没有凝集现象出现，可能试剂失效。7、最后各参加2滴Resuspending溶液，轻轻摇动试管并同时目测凝集是否散开，再进一步倒在玻片上用显微镜观察凝集是否散开。如果在60秒内凝集散开，说明是由Polybrene引起的非特异性凝集，配血结果相合；如果凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反响，配血结果不相合。如果想进一步检
7、测Anti-K抗体，则必须继续做辅助性的抗球蛋白试验，步骤如下：8、再滴入1滴Resuspending溶液。9、用生理盐水洗红细胞35次，并把最后一次上清液完全倒干。10、滴入2滴Anti-human IgG血清，并混匀。11、用穿插配血专用离心机3400rpm离心15s.12、观察有无凝集反响，如果有凝集反响，表示有Anti-K抗体，则必须进一步做抗体冲出试验，供血者的血液不适合病人使用。如果没有凝集反响，为了确保输血的安全性，须再各添加1滴致敏性红细胞至所有没有凝集的试管中，混匀，3400rpm离心1分钟。正常应有2+反响。如果没有凝集反响，可能是假阴性，辅助性抗球蛋白试验必须重做。结果判
8、断1、ABO同型配血，主侧和次侧均无溶血及凝集表示无输血禁忌，可以输血。2、如急需输血但一时无同型血液，作异型配血时指O型血输给A，B或AB型，或A，B型血输给AB型时，主侧无溶血及凝集，但次侧必然有凝集或溶血。质量控制与本卷须知1、在进展穿插配血试验时，一定要严格按操作规程进展，每进展一步操作，必须进展一次核对，防止操作错误，尤其防止主侧和次侧加样加错。操作方法应按规定先加血清，然后再加红细胞悬液，以便核实是否漏加血清。同时，注意区别凝聚胺所引起的凝集反响。2、受血者标本有效期为三天；假设受血者抽取标本后，输用过血液或血液制品，且输用时间超过12 小时的，必须重新采集标本。25%红细胞悬液要
9、求准确，必要时用生理盐水洗涤红细胞后重新配制。3、如果主侧发生凝集反响，说明配血不合，不管次侧配血如何都不能输血。如果仅次侧配血发生凝集反响，只有在紧急情况下才有可能考虑是否输血。4、可以用EDTA抗凝血浆代替血清使用，不能使用溶血标本及含有枸橼酸钠、肝素的抗凝血浆标本。5、加Polybrene溶液离心去上清后不凝集，可能是标本中含有肝素或其它干扰因子。假设病人血清(血浆)含有肝素或其它干扰因子，如洗肾患者，需多加46滴Polybrene溶液以中和肝素或其它干扰因子。6、红细胞悬液以35为宜，过浓或过淡可使抗原抗体比例不适当，反响不明显而易误判。7、未开封的试剂应储存于温度在225、相对湿度不
10、大于80%、无腐蚀性气体的环境中；已开封的试剂应储存于相对湿度不大于80%、无腐蚀性气体和通风良好的室温环境中；试剂用后应及时拧紧瓶盖保存；未开封试剂的有效期为两年，在有效期内已开封的试剂应在开封后的6个月内使用完。8、试管，滴管吸头和玻片必须清洁枯燥，防止溶血。9、离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结果。10、各种原因引起的红细胞溶解，易误判为不凝集，局部溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体。11、中国人极少有Anti-K抗体，但其他人种比例较高，尤其是白种人，所以，当病人是其他人种时，为求安全起见，应加做辅助性抗球蛋白试验。加做辅助性抗球蛋白试验是为了增加检测
11、Anti-K抗体的敏感度，对检测其他的抗体无帮助。所以，除非想进一步检测Anti-K抗体，否则不须做到辅助性抗球蛋白试验。12、进展穿插配血前逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者ABO血型正、反定型，并常规检查患者RhD血型，正确无误时可进展穿插配血。13、结果判断必须先肉眼观察，再进展显微镜观察。注意观察弱凝集和排除非特异性凝集。14、穿插配血试验中发现有不配合时，首先应考虑受血者和供血者的ABO血型和Rh(D)血型定型是否错误，必要时进展抗体筛检。其次，应注意有无特异性同种抗体，特异性未知的同种抗体存在，或者患者的血清在室温37或抗球蛋白血清中凝集所有的其他红细胞，造
12、成穿插配血的困难，应进一步作有关试验进展鉴定。15、两人值班时，穿插配血试验由两人互相核对；一人值班时，操作完毕后自己复核，并填写配血试验结果。按“穿插配血核对制度进展。16、各供血者间需进展穿插配血；已经输注的血液缺乏24 小时的，供血者间也需进展穿插配血。17、凝聚胺试剂还可用于辅助抗体筛检试验、辅助性抗人球蛋白试验和辅助性血型鉴定。具体操作方法详见凝聚胺试剂盒使用说明书。18、判断结果后应仔细核对、记录，防止笔误。穿插配血的影响因素及解决方法准确的穿插配血是临床安全有效输血的最后一条重要保证。输血配合是选择适合受血者输注的血液，使输血的成分能在受血者体内有效存活，并且无不良反响，即输入的
13、红细胞在受者体内必须不凝集和不溶血，输入的血浆成分不导致受者自身红细胞显著破坏，使受血者恢复安康。影响穿插配血的因素很多，主要如下： 1、标本血标本的采集错误、稀释和溶血。另从受检者采集l份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不合。标本一般要求离体后尽快实验，最长不能超过3天，每次输血后受血者和供血者的血标本应在28保存7天。患者的药物使用有时也对实验有一定影响，当受血者使用肝素治疗时，应使用硫酸鱼精蛋白对抗使标本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮PVP等治疗，应注意将红细胞洗涤。受检者红细胞上抗原位点过少(如亚型)或抗原性减弱(见于白血病或恶性肿瘤)，以及类B或cisA
14、B等。如疑为A抗原或B抗原减弱，则可将受检红细胞与抗A或抗B血清做吸收及放散试验，以及用受检者唾液作A、B、H血型物质测定只对80HAB分泌型的人有用。如受检者为A型血而疑为有类B抗原时，可用以下方法进展鉴别：(1) 观察细胞与抗A及抗B的凝集强度，与抗A的反响要比与抗B的反响强，这种区别用玻片法作试验更为明显；(2) 用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗B不凝集自身红细胞上的类B抗原；(3) 检查唾液中是否有A、B物质，如果是分泌型，可检出A物质而无B物质；(4) 核对患者的诊断，类B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。受检者血清中蛋白紊乱(高球蛋白血症)，或实验时温度过
15、高，常引起红胞呈缗钱状排列。如试验结果红细胞呈缗钱状排列，加等渗盐水l滴。混和，往往可使缗钱现象消失。注意不应先加盐水l滴于受检者血清中而后和红细胞做试验，以免使血清中抗体被稀释。细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。如发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的Cad抗原活性；被细菌酶激活的T或TK受体；或产生机制不太明了的Tn受体所引起。多凝集红细胞具有以下特点：(1)能被人和许多家兔的血清凝集；(2)能与大多数成年人的血清凝集，不管有无相应的同种抗体。(3)不被脐带血清凝集。(4)通常不与自身的血清凝集。(5)如有条件可用外源凝集素加以鉴别。 检者血清中缺乏应有的抗-A及或抗B抗体，如丙种球蛋白缺乏症，老年人血清中抗体水平大幅度下降等。如果试验结果未见凝集，应将
