广西地方标准《牛支原体的检测 多重聚合酶链反应法》（征求意见稿）编制说明一、项目的来源和目的牛支原体肺炎是一种全世界广泛存在的重要牛传染病,可引起肉牛肺炎、奶牛乳腺炎、犊牛关节炎和肺炎、角膜结膜炎、耳炎在美国，该病每年所造成损失达 1.40 亿美元；在欧洲,该病的发病率约 25%～33%，每年损失大约 1.44 亿～1.92亿欧元2008年，我国部分地区从国内其他地区引进的肉牛暴发了以坏死性肺炎为主要特征的疫情,最后证实为牛支原体肺炎随着我区近年来养牛业的快速发展，牛支原体肺炎成为了限制我区养牛业发展的严重病害之一，据本课题组调查，我区从山东、吉林等养牛大省引进的犊牛中基本都携带牛支原体 牛支原体肺炎临床以呼吸系统症状为主, 主要表现为发热、咳嗽、流鼻涕;剖检病变以坏死性肺炎为主(俗称“烂肺病”), 可见明显坏死性、干酪样病灶而引起无乳症的无乳支原体与牛支原体曾同属一个种, 也能感染牛群, 二者16S RNA 基因同源性很高所以实际工作中很难区分这两种支原体牛支原体肺炎检测技术主要是传统的病原分离和生化特性鉴定病原分离培养的条件苛刻，费时、费力、分离的成功率低生化特性鉴定又不容易将牛支原体与无乳支原体进行区分。
运用基于分子生物学技术的多重聚合酶链反应方法同时鉴定这两种支原体，是一种最为简便、快捷的方法，本规程旨在推广一种能快速检测牛支原体的多重聚合酶链反应方法，检测结果在半天内获得，其在我区的推广应用，为流行病学调查和临床诊断提供技术支持将为保障我区绿色养牛产业发展做出贡献聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是近年发展起来的一种分子生物学诊断技术，能在数小时内快速检测出痕量的病原核酸它具有传统病原分离鉴定和血清学方法所无法比拟的特异、敏感和快速等优势在发达国家，PCR已作为有效的病原检测手段得到了广泛应用世界动物卫生组织（OIE）也将PCR方法列为多种动物病原最为可靠的检测方法之一多重PCR技术一次反应可以检测多个基因，比单一PCR技术更为方便、快捷、经济，减轻了工作量因此建立特异性强、敏感性高、快速、简捷的多重PCR检测方法是当前牛支原体病防治和流行病学调查工作迫切需要解决的问题之一为此，广西壮族自治区质量技术监督局下达文件《关于下达2015年第二批广西地方标准制定（制订）项目计划通知》（桂质监函[2015]183号）附件的编写任务通知，将《牛支原体的检测 多重聚合酶链反应法》广西地方标准的编制任务落实到广西壮族自治区兽医研究所，接到任务后，广西壮族自治区兽医研究所结合近几年的科研情况和人员情况，成立了以李军为组长，杨威、彭昊、陈泽祥、潘艳、冯世文、许力干、陶立、马春霞、韦志锋、兰美益、秦若甫、谢永平等同志为成员的标准编制课题组，负责标准的起草工作。
本操作程序是在充分参考文献资料及实验和生产应用验证的基础上，制订出适合于临床快速诊断牛支原体和无乳支原体的检测标准二、工作概况（一）在检测方法研制方面的工作情况广西壮族自治区兽医研究所自2008年开展国家公益性行业（农业）专项“边境地区动物疫病预防控制技术体系研究”项目研究以及广西基本业务费“牛呼吸道疾病综合征病原学调查及快速检测方法的建立”等项目以来，在牛支原体相关研究上取得了以下研究成果：① 进行牛支原体流行病学调查，掌握了广西地区牛感染支原体的种类、感染率、宿主易感年龄、感染季节等流行病学资料②优化支原体培养基配方，缩短了支原体的分离培养时间③牛支原体的快速检测：基于opp D/F基因建立的牛支原体快速PCR检测方法，敏感性高，特异性好，只需一次扩增即可获得检测结果，能很好地与曾同牛支原体归为一个种, 也能感染牛群, 二者16S RNA 基因同源性很高的无乳支原体进行区分，在临床检测牛支原体上具有更好的应用性④无乳支原体的快速检测：基于P 80/F建立的无乳支原体快速PCR检测方法，敏感性高，特异性好，只需一次扩增即可获得检测结果，能很好地区分牛支原体，在临床上应用取得了良好的效果。
⑤牛支原体多重PCR方法的建立：根据牛支原体opp D/F基因和无乳支原体P 80/F基因，设计合成两对特异性引物，进行牛支原体和无乳支原体的临床检测PCR扩增长度分别为448bp和375bp，通过反应条件的优化以及特异性试验、敏感性试验、重复性试验及扩增片段序列测定的验证，证实该方法可以快速便捷检测牛支原体及无乳支原体，并进行有效区分，可用于牛支原体的流行病学调查及临床诊断二）在标准起草方面的工作情况为了确保制定的标准具有科学性、先进性、实用性和可操作性，标准编制课题组根据工作方案和任务要求进行了分工，分成2个小组，其中一个小组负责做生产实践的调查研究，深入到广西南宁、贵港、来宾、柳州、北海、玉林等地一些规模化牛场及散养户进行实地调查研究，了解我区牛养殖及疫病防控有关情况，并查阅相关的技术档案和规章制定，收集流行病学资料；另一个小组负责查阅国内外牛支原体检测方面的标准、技术资料和研究报告最后课题组将两个小组收集的材料进行汇总和整理，开始起草标准征求意见稿，于2015年8月完成了标准征求意见稿的起草工作，在征求陈家贵等10位专家的意见后，认真按照专家意见进行修改，于9月中旬完成了标准送审稿的起草。
三、标准主要内容及依据本标准是动物疫病防控地方标准，因此标准编写的重点是动物疫病的检测本标准借鉴国内外先进的研究成果和技术内容，编写的主要内容为样品的采集，样品的处理，多重PCR操作过程以及结果的判定本标准适用于牛支原体和无乳支原体的检测四、开展技术操作测试（验证）情况和预期效果采用建立的牛支原体多重PCR方法和传统的支原体分离培养观察法、ELISA检测方法，对采集自广西南宁、柳州、贵港等地的规模化牛场和散养户176份病料进行牛支原体检测，牛支原体阳性病料为31份，无乳支原体阳性病料14份反复比较验证这3种检测方法，测序验证，证实多重PCR方法最为敏感实用支原体分离培养观察法需要复杂的支原体培养，并需要较高的实验培养技能，耗时较长，难度较大；ELISA方法检测抗原也有赖于支原体的培养纯化处理，对检测人员技术要求更高、耗时更长，而建立的牛支原体多重PCR方法具有更为稳定、快速、便捷的优点，可以在临床上进行推广应用五、与现行法律、法规和有关标准的关系国家标准GB/T14926.8-2001《实验动物支原体检测方法》采用支原体分离培养方法，对实验动物的支原体进行观察检验，对实验设备、试剂和操作人员要求较高；而本标准针对我国牛病料中的牛支原体和无乳支原体病原体进行检测。
本标准制定的条款没有与现行的法律、法规及有关的国家标准中任何条款相矛盾六、采用国际标准或国外先进标准的情况在牛支原体的认定和检测等方面，以国际同类标准的编写方法为基础国际通用的牛支原体检测方法为支原体分离培养方法，对实验设备、检测试剂和操作人员要求较高，而本标准结合国内外研究成果，进行充分规范和创新，更具有先进性七、贯彻标准的措施和建议本标准中的检测方法，试验数据充分、科学性强，通过实验室和临床应用的反复验证，可作为推荐性地方标准在牛支原体的检测工作中进一步推广应用因本标准技术方法直接针对病原基因进行检测，敏感性非常高，所以在操作过程中要特别注意避免样品交叉污染而出现的假阳性结果此外，为规范实验操作，建议在应用本标准之前，先对操作人员进行技术培训，建议以培训班的形式推广本标准。